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大鼠脊髓去细胞支架化学萃取方法的初步探讨
脊髓损伤是脊柱外科常见疾病,制备脊髓去细胞支架,获得大然的脊髓基质和三维结构,构建组织工程化脊髓,可能有助于改变目前脊髓损伤治疗效果不理想的现状.应用化学萃取的方法可有效制备同种异体外周神经去细胞支架,而且不出现宿主免疫排斥反应[1-2].本研究采用Sondeli等[3]报道的方法萃取大鼠脊髓,观察其形态学变化特点,为制备具有天然脊髓结构的组织工程化脊髓提供理论依据.
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光氧化反应增加去细胞牛颈静脉的组织稳定性
目的:观察去细胞及去细胞后光氧化反应对牛颈静脉的组织稳定性的影响.方法:实验于2005-06/09在中南大学湘雅二医院胸心外科实验室完成.①将新鲜牛颈静脉纵形剪开成血管片,横行切取牛颈静脉血管片成6根血管条,随机分为6组,新鲜组,去细胞组,及根据不同的光氧化处理时间将去细胞结合光氧化处理组分为去细胞后光氧化反应12,24,36和48 h组.②通过测定处理前后的组织厚度、热皱缩温度、抗张强度及组织蛋白提取分析来比较组织稳定性.结果:①各组在处理前后的厚度:去细胞处理后血管片比处理前变薄[(0.36±0.85),(0.43±0.94)mm,P＜0.05],而去细胞再光氧化处理后的血管片厚度无明显改变(P＞0.05).②各组血管片组织稳定性评价:去细胞组热皱缩温度及抗张强度比新鲜组、去细胞后光氧化反应12 h组、24 h组、36 h组、48 h组明显降低[热皱缩温度:(69.75±0.54),(72.50±0.53),(73.80±0.59),(74.40±0.46),(75.10±0.21),(75.20±0.26)℃,P＜0.05;抗张强度:(3.13±0.94),(5.19±0.65),(4.54±0.88),(4.67±0.60),(5.55±0.43),(5.80±0.82)MPa,P＜0.05];经光氧化处理后热皱缩温度上升且高于新鲜组(P＜0.05);而大应力与新鲜组比较无明显变化(P＞0.05);去细胞后光氧化反应组的组织蛋白提取量明显少于新鲜组及去细胞组,且随光氧化反应时间延长,组织蛋白提取量逐步减少.结论:去细胞处理降低了牛颈静脉的组织稳定性,而经光氧化进一步处理后组织稳定性增强,且随光氧化时间延长组织稳定性增强.
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体外构建组织工程心脏瓣膜动物实验初步研究
目的探讨应用去细胞猪主动脉支架(decellularized porcine a ortic valve scaffold,APAVS)与兔骨髓干细胞(rabbit bone marrow stromal cells,RBMS Cs)体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性.方法采用去垢剂-核酸酶消化法处理,去除猪主动脉瓣细胞成分 ,并做去细胞前后的形态学检查和生物力学测定;在去细胞支架上种植兔骨髓干细胞,行形态学检查和免疫组化测定.结果光镜及电镜证实,猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除, 获得完整无细胞的纤维网状支架;瓣叶去细胞前后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化;种植的RBMSCs可在ACPAV表面形成一层连续的细胞层.结论种植RBMSCs于ACPAV上,可体外构造组织工程人工心脏瓣膜.
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两种不同去污剂制备肺去细胞支架的对比
目的:比较离子型洗涤剂十二烷基磺酸钠(SDS)与脱氧胆酸钠针对肺去细胞支架制备的性能,寻找一种合适的肺去细胞方法以得到模拟可以促进细胞附着和分化天然细胞外基质的肺功能架构.方法:SD大鼠随机分成正常对照组、去细胞SDS组、去细胞脱氧胆酸钠组,分别取心、肺联合体,两组去细胞组均经右心室置入留置针至肺主动脉.去细胞SDS组使用肝素、Triton X-100、SDS溶液和去离子水依次灌注;去细胞脱氧胆酸钠组使用肝素、Triton X-100、脱氧胆酸钠溶液和去离子水依次灌注.各组分别采用扫描电镜观察支架结构;H-E染色、Masson三色染色观察残留细胞、细胞核成分;免疫荧光染色观察肺组织层黏连蛋白、纤维连接蛋白保留情况,并进行DNA含量测定.结果:扫描电镜显示去细胞SDS组支架肺泡结构较去细胞脱氧胆酸钠组完整;H-E染色显示去细胞SDS组肺支架未见明显细胞及细胞核成分残留,去细胞脱氧胆酸钠组可见少量细胞核成分残留;Masson染色显示去细胞SDS组弹性纤维保留优于去细胞脱氧胆酸钠组;免疫荧光显示去细胞SDS组层黏连蛋白和纤维连接蛋白结构较去细胞脱氧胆酸钠组完整,保留度较高;去细胞SDS组DNA含量为(35.28±8.20) ng/mg,明显低于去细胞脱氧胆酸钠组(52.33±7.67) ng/mg,差异有统计学意义.结论:两种去污剂均可有效清除肺内细胞成分,较好地保留细胞外基质,其中SDS溶液灌注法优于脱氧胆酸钠溶液灌注法.
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猪主动脉瓣叶去细胞后种植内皮细胞的实验研究
组织工程心脏瓣膜的研究和临床应用有广阔的前景,天然生物源性支架因能为种植细胞提供一个黏附、生长的良好环境而受到重视[1].本研究采用胰酶-EDTA、表面活性剂Triton X-100、核酸酶作用于猪主动脉瓣,观察能否去除瓣叶组织中的细胞,以及在其表面种植牛主动脉内皮细胞(bovine aortic endothelial cells,BAECs)的生长情况,探讨其用来构建组织工程瓣膜的可行性.
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直接染色法观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长
为了快速观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长状况,采用去细胞猪主动脉瓣叶为支架,将新生牛主动脉内皮细胞种植于其上,第3、7天取瓣叶行H-E直接染色,并以常规切片H-E染色和扫描电镜作为对照.结果发现,该3种方法观察所见细胞第3、7天的生长疏密状况基本同步.提示,瓣叶H-E直接染色可方便快捷地观察种植细胞的生长状况.
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猪主动脉组织工程瓣膜制备的初步研究
目的:初步探索猪主动脉组织工程瓣膜的制备方法. 方法:经胰酶-EDTA、表面活性剂、核酸酶处理,去除猪主动脉瓣的细胞成分, 测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性,并在其表面种植BAECs.结果:猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全被去除,获得完整无细胞的纤维网状支架,瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化,瓣膜近端存留的主动脉壁中的细胞一半被去除 ;种植的BAECs在去细胞瓣膜表面、主动脉内膜形成一连续的细胞层.结论:猪主动脉瓣膜去细胞后获得的纤维支架适宜血管内皮细胞的生长,可以用来构建组织工程瓣膜.
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组织工程心脏瓣膜:去细胞瓣膜支架及其应用
在过去的十余年中,组织工程心脏瓣膜(TEHV)成为是瓣膜外科的研究热点之一.TEHV理论上能克服现有机械瓣和生物瓣的不足,具有生长性、不需抗凝、不易退行性变和钙化等优点,因而有广阔的临床应用前景.用于构建TEHV的支架主要是高分子材料和天然去细胞材料,其中天然去细胞支架近年来越来越多的被用于构建TEHV.本文就去细胞瓣膜支架的重要相关特性和应用做一综述.
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大鼠环杓后肌与腓肠肌去细胞支架的制备和比较研究
目的:制备大鼠环杓后肌和腓肠肌的去细胞支架并比较二者的差异,为构建组织工程环杓后肌提供依据.方法:选取SD大鼠60只,随机分为6个组,包括5个实验组和1个对照组,每组10只.实验组分别为去细胞处理后2、4、6、8和10 d组.经1％SDS溶液去细胞后,作大体观察、组织切片及苏木精-伊红、胶原纤维染色、扫描电镜观察并测量孔隙直径及面积,提取和检测DNA.对照组不作去细胞处理.结果:实验组大体上呈白色半透明状,对照组则色泽红润.实验4d组环杓后肌和8d组腓肠肌的肌纤维完全消失,细胞外基质结构保留良好,未检测出DNA.扫描电镜发现环杓后肌和腓肠肌的孔隙形态不同,且2组的孔隙直径差异有统计学意义(P＜0.05),实验4d组环杓后肌支架的孔隙直径大于8d组腓肠肌支架.结论:与腓肠肌相比,环杓后肌去细胞支架具有孔隙形态及直径方面的优势,更适合作为组织工程环杓后肌的支架材料.
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去细胞支架介导EPCs归巢大鼠半肾损伤
目的：观察去细胞支架介导内皮祖细胞归巢大鼠半肾再生的可行性，为细胞移植治疗中去细胞支架材料的应用提供理论依据。方法2014年9月至2015年4月，采用密度梯度离心法分离，体外诱导培养大鼠骨髓单个核细胞；用Triton X－100和SDS 联合灌注法制备大鼠双肾去细胞支架；实验组大鼠予左侧半肾切除后缝合支架，对照组予半肾切除后切缘缝合，术后将体外扩增培养的EPCs进行CM－Dil标记后注入大鼠模型内。观察EPCs在大鼠体内各主要脏器的分布，比较两组不同处理对EPCs归巢的作用。结果在体外诱导培养10 d 的EPCs 可共吞噬表达Dil-acLDL与FITC－UEA－1，能有效的被CM－Dil标记；经过灌注法制备的双肾去细胞支架经HE染色后无明显细胞核残留，且细胞外基质连续，DNA 残留量为（4．9±0．57）μg／g；经标记后的EPCs移植到模型体内后，残留的半肾、支架部位及脾脏中均发现大量标记细胞，且实验组残留半肾中标记的EPCs数量（28．8±3．5）明显比对照组多（1．2±0．8）（P＜0．05）。结论去细胞支架介导EPCs移植可有效促进EPCs归巢，为研究干和（或）祖细胞移植治疗组织器官修复再生提供了一个新的研究方法。
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去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植
目的探讨猪主动脉瓣叶去细胞后作为组织工程心脏瓣膜支架的可行性. 方法经胰酶-EDTA、表面活性剂和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性,并在其表面种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs);分别行大鼠皮下包埋实验. 结果猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除,获得完整无细胞的纤维网状支架,断裂强度和断裂伸长率无明显变化;种植的BAECs在去细胞瓣叶表面可形成一层连续的细胞层,其分泌前列环素(PGI2)的能力同直接种植在24孔板中的比较,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论猪主动脉瓣去细胞后获得的纤维支架可以用来构建组织工程瓣膜,适宜于血管内皮细胞的生长.
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去细胞猪主动脉瓣支架及兔骨髓干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究
目的探讨应用去细胞猪主动脉瓣支架(acellularized porcine aortic valve scaffold,APAVS)与兔骨髓干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外构建组织工程瓣膜的可行性.方法采用去垢剂+核酸酶消化法处理,去除猪主动脉瓣细胞成分,并作去细胞前后的形态学检查和生物力学测定;在去细胞支架上种植兔BMSCs,行形态学检查和免疫组织化学染色观察.结果光学显微镜、扫描及透射电子显微镜下可见猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全被去除,获得完整无细胞的纤维网状支架.瓣叶去细胞前后的断裂强度(642±102g/mm2vs.636±127g/mm2)和断裂伸长率(62.2%士18.1%vs.54.4%±16.0%)差别无统计学意义(P＞0.05).种植的兔BMSCs在APAVS表面形成一层连续的细胞层.免疫组织化学检查α-平滑肌动蛋白抗体(+),CD31(-). 结论种植兔BMSCs于APAVS上,可在体外构建组织工程心脏瓣膜.
