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实验犬环杓后肌功能重建的组织化学研究及图像分析
为了确定并比较实验犬两种不同术式:Ⅰ.颈袢胸骨舌骨肌支肌蒂移植术;Ⅱ.副神经胸锁乳突肌支肌蒂移植术,治疗声带麻痹的效果.建立单侧联合性声带麻痹动物模型,分别用Ⅰ、Ⅱ两种术式移植神经肌蒂于失神经的环杓后肌(PCAM).术后4个月取各组PCAM做超微结构检查,并做光镜组织化学:乙酰胆碱酯酶(AChE)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、糖原(PAS)反应.用图像分析定量并测示肌纤维直径.结果发现两种术式都能使PCAM恢复功能,第Ⅱ种术式组织化学结果优于第Ⅰ种术式.为治疗声带麻痹提供了重要的理论根据.
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舌骨上肌与喉内肌的同步肌电生理实验研究
目的 对犬的舌骨上肌(二腹肌前腹、后腹,茎突舌骨肌,下颌舌骨肌和颏舌骨肌)与喉内肌(环杓侧肌和环杓后肌)进行同步肌电图研究.方法 检测13只犬同步肌电图.结果 ①呼吸时环杓侧肌在呼气相放电,余各肌在吸气相放电.深呼吸时诸肌放电强度增加.②吞咽时诸肌和环杓侧肌呈同步放电.环杓后肌肌电抑制,间歇期可见肌电位发放.③发音时二腹肌前腹、后腹和环杓侧肌呈同步性密集型放电,环杓后肌在发音过程中持续放电,动作电位出现时间较迟.茎突舌骨肌和颏舌骨肌无明显肌电活动.结论 ①发音及吞咽时下颌舌骨肌与环杓侧肌同步且相似,可作为重建声门内收功能的备选肌肉;②吸气时颏舌骨肌与环杓后肌同步且相似,可作为重建声带外展功能的备选肌肉.
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慢性电刺激对喉肌神经再支配的作用
为明确功能性电刺激对环杓后肌(PCA)神经再支配的作用,本文采用4条犬,均将右侧喉返神经切断再吻合,套上含有双极刺激的硅胶套,并将喉起搏器电刺激系统植入2条犬的左侧PCA中,另2犬作对照植入电极为5mm×5mm大小,包括多个刺激电极及记录电极,以保证PCA肌各个部位均受到刺激及不同部位的电位均能记录.另外诱发电位的刺激电极置于修复侧喉返神经近侧端,2周后记录PCA肌的自发及诱发电位,每只动物PCA肌的部位与电位关系绘成坐标图.
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人类喉肌纤维的肌凝蛋白重链表达
肌凝蛋白重链(MHC)是肌节重丝的主要成分,肌肉的MHC成分决定它的收缩速度,与肌原纤维肌动凝蛋白的ATP酶在不同pH水平的活性有关.Ⅱ型纤维显示肌原纤维ATP酶在碱性pH中的高活性,在酸性pH中的低活性,并且以快ⅡA或快ⅡB MHC的表达为特征,而Ⅰ型纤维则相反(慢收缩)包含慢MHC.成人四肢肌肉主要以快纤维为主(60%),而另一些肌肉如咬肌、膈肌、环杓后肌则主要以Ⅰ型纤维为主,不同的MHC异构型(MHCs)已在发育过程和不同的成人肌肉中得到确认.
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喉返神经-膈神经端侧吻合术重建环杓后肌功能的实验研究
目的研究喉返神经-膈神经端侧吻合术重建环杓后肌功能的可行性及疗效,探讨双侧喉返神经麻痹的手术治疗方式.方法建立大鼠右侧喉返神经伤断的模型,并在切断喉返神经内收肌支后,分组进行喉返神经-膈神经端侧吻合,喉返神经-膈神经端端吻合和喉返神经端端吻合.术后2个月时行纤维喉镜检查,以观察术侧声带外展恢复情况,并行双侧环杓后肌肌电图检查,得出术侧与健侧诱发动作电位潜伏期和峰值的恢复率.结果术后2个月时,右侧声带运动恢复情况和环杓后肌肌电图均显示喉返神经端端吻合组效果好,喉返神经-膈神经端侧吻合组和喉返神经-膈神经端端吻合组效果无显著差异.结论双侧喉返神经伤断的手术治疗应首选喉返神经端端吻合术;喉返神经-膈神经端侧吻合术有可能用于双侧喉返神经麻痹的治疗.
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失喉返神经支配的人环杓后肌成肌调节因子myogenin表达的变化
目的:观察不同时限失神经状态下人环杓后肌成肌调节因子myogenin的表达变化,为喉神经修复时限的选择奠定基础.方法:取38例喉返神经完全离断患者的环杓后肌标本,按神经离断时限分为4组:失神经6～12个月(n=12)、1～2年(n=10)、2～3年(n=8)及＞3年组(n=8),另取12例正常环杓后肌标本作为对照,各组患者的年龄、性别比例具有可比性.免疫荧光染色、实时定量PCR法比较各组环杓后肌myogenin蛋白及mRNA的表达.结果:免疫荧光染色结果显示:myogenin阳性表达主要定位于失神经3年内的环杓后肌肌细胞核,对照组正常环杓后肌基本无阳性表达;与正常对照组相比,失神经6～12个月组肌细胞核myogenin表达程度及阳性细胞百分比升高,1～2年组表达高,2～3年组逐渐下降,但仍显著高于对照组(P均＜0.01),而3年以上组基本无阳性表达,与对照组无显著差异.实时定量PCR结果表明:对照组myogenin mRNA未表达,失神经1～2年组myogenin mRNA表达水平为6～12个月组的4倍,失神经2～3年组为其64倍,失神经3年以上组仅为其1/2(P均＜0.01).结论:失喉返神经支配的环杓后肌肌纤维3年内有较大的再生潜力.
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长期失神经支配人的环杓后肌形态观察的研究
目的:探讨长期失喉返神经后人的环杓后肌形态学的变化规律, 为临床晚期喉神经修复的有效性提供理论依据.方法:不同时限喉返神经损伤的患者环杓后肌标本按神经损伤时限分为4个组:6～12个月(12例)、1～2年(10例)、2～3年(8例)及大于3年组(8例).以正常环杓后肌作为对照组(12例).采用MASSON三色染色、图像分析系统定量分析失神经后喉肌截面的肌纤维和胶原结缔组织纤维截面积的变化;采用肌肉琥珀酸脱氢酶(SDH)染色和运动终板胆碱酯酶(AchE) 染色,细胞计数分析失神经不同时限的环杓后肌两类肌纤维和运动终板数量的变化.结果:随着失神经时限的延长,胶原纤维截面积逐渐增加,而肌纤维的截面积逐渐减少.各组间比较均有显著性差异(P＜0.01),失神经0.5～2年内肌肉截面积/胶原截面积比率下降为明显,失神经2年以后肌纤维化明显减缓,但失神经3年后仍残留肌纤维相对截面积为正常对照组的48%.长期失神经后会导致肌纤维类型发生变化,红肌的比例逐渐上升,白肌的比例逐渐下降,各组间比较均有显著性差异(P＜0.01).运动终板的数量随失神经时限的延长而减少,1年以上标本未观察到AchE染色的运动终板.结论:长期失神经喉肌和胶原结缔组织截面积变化提示失神经2年内是肌肉纤维化严重时期,但失神经3年后仍残留肌纤维相对截面积为正常对照组的48%.失神经后喉肌纤维类型的变化提示该变化的目的是为了减少肌细胞凋亡.人环杓后肌运动终板消失时限为1年.本实验表明晚期神经修复仍能获得部分或全部喉功能是有其形态学基础.
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失神经支配对人喉内收肌和外展肌肌纤维形态的影响
目的:探讨失喉返神经支配对人喉内收肌和外展肌肌纤维形态学的影响规律,为临床晚期喉返神经修复的可行性提供实验依据.方法:内收肌取自环杓侧肌,外展肌取自环杓后肌,人正常环杓侧肌和环杓后肌作为正常对照组(各7例),失神经支配组按喉返神经损伤的不同时限分组:38例环杓后肌中,0.5～1年组7例,＞1～2年组10例,＞2～3年组8例,＞3～6年组8例,＞6年组5例;29例环杓侧肌中,0.5～1年组7例,＞1～2年组6例,＞2～3年组6例,＞3～6年组6例,＞6年组4例.分别采用苏木精-伊红染色、Masson三色染色,图像分析系统定量分析失喉返神经支配后喉内收肌和外展肌肌纤维截面积和胶原结缔组织截面积的变化.结果:随着失神经时限的延长,肌纤维的截面积逐渐缩小,而胶原纤维截面积逐渐增加.①环杓侧肌失神经0.5～1年组、＞1～2年组、＞2～3年组间比较差异无统计学意义(P＞0.05),失神经＞3～6年组肌肉/胶原截面积比下降为明显,与失神经＞2～3年组差异有统计学意义(P＜0.05)；②环杓后肌正常对照组与失神经0.5～1年组、＞1～2年组、＞2～3年组、＞3～6年组间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)；③环杓侧肌与环杓后肌失神经＞3～6年组与＞6年组比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05)；④失神经支配1年以后的各组环杓侧肌的肌纤维截面积都明显大于环杓后肌(P＜0.05).结论:失神经支配对喉内肌肌纤维形态学的影响存在差异,以环杓侧肌为代表的喉内收肌肌萎缩速率慢于以环杓后肌为代表的喉外展肌.失神经0.5～1年和＞3～6年分别是环杓后肌和环杓侧肌肌纤维形态转变的关键期,提示恢复环杓后肌声带外展功能的神经再支配手术应尽量选择在损伤1年内进行,而恢复环杓侧肌声带内收功能的神经再支配手术可以选择在损伤3年内进行,适时的临床干预可延缓喉肌进一步萎缩纤维化,且此时的喉肌尚具备较好的肌肉再生的形态学基础.
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大鼠环杓后肌与腓肠肌去细胞支架的制备和比较研究
目的:制备大鼠环杓后肌和腓肠肌的去细胞支架并比较二者的差异,为构建组织工程环杓后肌提供依据.方法:选取SD大鼠60只,随机分为6个组,包括5个实验组和1个对照组,每组10只.实验组分别为去细胞处理后2、4、6、8和10 d组.经1％SDS溶液去细胞后,作大体观察、组织切片及苏木精-伊红、胶原纤维染色、扫描电镜观察并测量孔隙直径及面积,提取和检测DNA.对照组不作去细胞处理.结果:实验组大体上呈白色半透明状,对照组则色泽红润.实验4d组环杓后肌和8d组腓肠肌的肌纤维完全消失,细胞外基质结构保留良好,未检测出DNA.扫描电镜发现环杓后肌和腓肠肌的孔隙形态不同,且2组的孔隙直径差异有统计学意义(P＜0.05),实验4d组环杓后肌支架的孔隙直径大于8d组腓肠肌支架.结论:与腓肠肌相比,环杓后肌去细胞支架具有孔隙形态及直径方面的优势,更适合作为组织工程环杓后肌的支架材料.
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失神经支配环杓后肌形态及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3表达的研究
目的：探讨长期失神经支配环杓后肌形态学及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）表达水平的变化，为晚期喉神经修复选择时限提供参考。方法45例不同时间喉返神经损伤患者的环杓后肌标本按神经损伤时间分为3组：3～6个月（18例）、7～12个月（15例）、13～24个月（12例）；取行喉全切除术喉癌患者未受肿瘤侵犯侧的正常环杓后肌标本作为正常对照组（12例），各组标本均通过 H E染色观察肌肉形态，通过免疫组化染色、Western blot观察环杓后肌Caspase－3表达的变化趋势。结果随着失神经时间的延长，环杓后肌肌纤维细胞有不同程度的变性，肌细胞核内移、集中，呈串珠状排列。失神经各组Caspase－3在肌细胞核均有表达，3～6个月组表达量高，其他各组逐渐下降，而对照组基本无表达。Western blot结果显示，对照组、失神经3～6个月、7～12个月、13～24个月组Caspase－3的相对表达量分别为1．30±0．03、20．78±0．11、11．33±0．43、3．14±0．17，失神经3～6个月组为对照组的21倍，7～12个月组为对照组的11倍，13～24个月组为对照组的3倍。结论失神经支配1年内是喉肌凋亡较严重时期，以后凋亡速度减慢，喉神经修复应尽量在1年内进行。
关键词： 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 失神经支配 环杓后肌 凋亡 -
特发性声带麻痹患者环杓后肌肌纤维形态观察
目的：探讨特发性声带麻痹患者环杓后肌肌纤维形态变化规律，为其治疗方法的选择提供依据。方法39例声带麻痹患者分成特发性声带麻痹组（特发组，n＝16）及创伤性声带麻痹组（创伤组，n＝23），二组根据病程再分别分为三个亚组：0．5～1年组（分别为5例及7例）、＞1～2年组（分别为5例及10例）、＞2年组（分别为6例及6例），分别取各组患侧的部分环杓后肌；另取5例正常人环杓后肌为正常对照组；行 masson三色染色法染色，Image Pro Plus图像分析系统分析环杓后肌相对肌肉截面积和胶原相对截面积的变化，并比较各组间的差异。结果随着病程延长，特发性声带麻痹组环杓后肌的肌纤维细胞逐渐萎缩，截面积减小，胶原纤维细胞逐渐增加，胶原纤维截面积增加；肌肉截面积／胶原截面积比率逐渐下降，以0．5～1年组的截面积比下降为明显；各亚组环杓后肌相对截面积较对照组明显减小（P＜0．05），胶原相对截面积较正常对照组明显增大（P＜0．05）；＞2年组和＞1～2年组之间比较差异无统计意义（P＞0．05）。特发组与创伤组相同时间段亚组环杓后肌和胶原纤维截面积分别两两比较差异均无统计学意义（均为 P＞0．05）。特发组有的病例尽管病程长达10年，但环杓后肌萎缩纤维化并不严重，而有的病例虽然病程仅1．5年，但肌肉萎缩却非常明显，存在较大个体差异。结论特发性声带麻痹患者病程半年以上者，环杓后肌肌肉截面积与胶原截面积比下降明显，故对于保守治疗半年以上声嘶无改善者，可考虑尽快行喉返神经修复术（1年内）；对于病程较长者（＞2年），部分病例可能仍存在进行神经修复的肌肉形态学基础。
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长期失喉返神经支配患者环杓后肌GDNF及其受体GDNFR-α1变化的研究
目的 探讨长期失喉返神经支配后,人环杓后肌胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derivedneurotrophic factor,GDNF)及其受体GDNFR-αl的变化规律.方法 38例不同时限喉返神经损伤的患者,按神经损伤时限归入0.5～年、1～年、2～年、≥3年组.对照组12例,为因喉癌行喉全切除术且肿瘤未侵及环杓后肌者.采用免疫荧光双标记法分别标记GDNF和GDNFRαl,运用图像分析系统对环杓后肌GDNF和GDNFRαl表达变化进行评估.结果 失神经0.5～年组、1～年组环杓后肌GDNF和GDNFR-αl表达的平均灰度值和阳性区百分比显著高于其他各组(P<0.001),失神经0.5～年组明显高于失神经1～年组(P<0.001).对照组、失神经2～年组、失神经≥3年组之间无显著性差异(P>0.05).结论 失神经支配1年内环杓后肌GDNF和GDNFR-αl表达较高,失神经支配1～2年内环杓后肌GDNF和GDNFR-αl仍有表达,说明失神经支配2年以内喉肌GDNF的功能状态较好.
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去神经支配后大鼠环杓后肌不同类型肌纤维的mRNA表达
目的 研究去神经支配后大鼠环杓后肌不同类型肌纤维蛋白mRNA表达的变化.方法 以切除单侧喉返神经后40天的8只大鼠的环杓后肌作为研究对象,使用实时定量PCR方法测定环杓后肌胶原Ⅲ、肌纤维蛋白各亚型的mRNA表达,并与正常对照组相比较.结果 去神经支配40天的大鼠环杓后肌,各亚型纤维蛋白的重链mRNA表达与正常对照组比较差异无统计学意义.但是Ⅰ/ⅡB亚型纤维蛋白的mRNA表达的比值与对照组比较差异有统计学意义(P=0.018).结论 大鼠去神经支配40天时大鼠环杓后肌重链肌动蛋白Ⅰ/ⅡB亚型纤维mRNA表达的比值增加,提示该肌肉的收缩力有减弱的趋势.
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喉发声功能检查(续6)
4.1.5.3 检查方法： ①被检者取平卧位，用碘酒、酒精行颈前部消毒。 ②麻醉：向环甲间隙浅面皮内注射0.2 ml1%普鲁卡因，再向喉腔内注射1%地卡因1～2 ml。 ③插入电极方法：自环状软骨弓上方将双极同心针电极垂直刺入环状软骨弓之软骨膜表面，然后将电极向后、上、外的方向进针约5 mm，即达环甲肌。向环杓后肌插针时，自环甲间隙中央刺入声门下腔，将电极尖端偏向检侧，抵至及穿过该侧之环状软骨板即达此肌。
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喉发声功能检查(续5)
4 肌电图在喉科的应用4.1 应用于喉科科研 肌电图主要通过两种方式应用于喉科的科研工作。第一是应用于动物试验；第二是应用于人体检查。4.1.1 喉内肌生理的动物试验研究 我们用肌电图研究了环甲肌(CT)和环杓后肌(PCA)的生理功能。现将实验方法及结果报告如下：4.1.1.1 一般情况 ①记录仪：用国产JD-2型双导程记录仪。 ②记录电极：单、双极同心针电极。 ③照相机：用SB-408-B型示波器照相机，拍摄肌电波形。 ④受试对象：21只体重15～20公斤的杂种健康成年犬。 ⑤麻醉：用硫喷妥钠腹腔内麻醉，30～40 mg/kg ⑥检查前准备：麻醉成功后，颈前部去毛。将犬仰卧检查台上，固定四肢及上颌，悬吊下颌，常规消毒、铺巾。
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喉发声功能检查(续3)
2 正常肌电图2.1 电静息正常骨骼肌完全处于松弛状态时,当电极插入到肌内,肌纤维无动作电位出现,荧光屏上呈一直线,称电静息(electrical silence).但喉内肌很难在正常情况下出现静息电位,如甲杓肌因受呼吸的影响,很难完全静止,也就很难出现静息电位.环甲肌既是一个吸气放电的肌肉,又有内收作用.当声带处于外展位时,它有内收到旁正中位的作用,所以很难达到完全静止状态,也就很难出现电静息.环杓后肌有两种纤维,一种是紧张纤维(tonic fibre),一种是期相纤维(phase fibre),所以它很难出现静息电位,一般都是连续电位.
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双侧颈袢神经再支配环杓后肌电生理特性研究
目的:将颈袢神经同喉返神经远心端吻合常常使用在重建喉肌功能的手术中,吻合后环杓后肌的电生理特性可能发生改变,我们为研究环杓后肌的电生理变化而做此研究.方法:14只混种狗被随机分为两组,一组动物暴露双侧喉返神经后,将其切断,立即将颈袢神经同其相吻合,为实验组.另一组动物为正常对照组.9周后,暴露吻合处,采用功能性电刺激刺激环杓后肌,并记录对应的声门开大电刺激电压阈值和声门开大声带移动阈值.正常对照组同样测量这两个值.结果:实验组的声门开大电刺激电压阈值是(4.864±1.46)V,声门开大声带移动阈值是(0.46±0.15)V,而正常对照组的两个值分别是(3.36±1.25)V和(0.39±0.21)V,两组间差异没有统计学意义(P>0.05).结论:使用颈袢神经吻合喉返神经重建9周后,环杓后肌电生理特性较正常动物没有明显改变.提示使用较小的电刺激就能够促使颈袢神经重建的环杓后肌发生收缩,从而达到开大声门的作用.
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食管癌手术的喉返神经保护与淋巴结清扫
喉返神经是喉部的主要运动神经。其自迷走神经进入胸腔后发出，两侧走行不同。右侧喉返神经在锁骨下动脉之前离开迷走神经主干，绕动脉的前、下、后再折向上行，沿气管食管沟的前方上升（大部分沿气管食管沟的外侧上行），在环状软骨后方进入喉内。左侧喉返神经行走途径较长，在迷走神经过主动脉弓时离开迷走神经主干，绕主动脉弓部之前、下、后，然后沿气管食管沟上行（多位于气管食管沟内），在环甲关节后方进入喉内。喉返神经多分为前后两支，前支支配内收肌(环杓侧肌甲杓肌及会厌肌)，后支支配外展肌(环杓后肌、杓间肌)。
