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蛋氨酸合成酶还原酶基因多态性与不明原因复发性流产的相关性
目的 探讨蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR) A66G基因多态性与不明原因复发性流产(URSA)的相关性.方法 采用PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法,对200对河南汉族URSA夫妇(URSA组)及76对有健康生育史的河南汉族夫妇(对照组)的基因型进行分析.结果 (1) MTRR A66G等位基因频率:MTRR A66G等位基因A和G的频率URSA组分别为男性76.5％(153/200)、女性72.8％ (146/200)；男性23.5％ (47/200)、女性27.2％ (54/200)；对照组分别为男性78.9％ (60/76)、女性78.3％ (59/76)；男性21.1％(16/76)、女性21.7％ (16/76).MTRR A66G等位基因频率在各组不同性别者及两组同性别者间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).(2) MTRR A66G基因型频率:MTRR A66G基因型AA、AG、GG频率URSA组分别为男性57.0％ (114/200)、女性52.0％(104/200)；男性39.0％ (78/200)、女性41.5％ (83/200)；男性4.0％(8/200)、女性6.5％(13/200)；对照组分别为男性59.2％(45/76)、女性59.2％(50/76)；男性39.5％(30/76)、女性38.2％ (29/76)；男性1.3％ (1/76)、女性2.6％ (2/76).MTRR A66G基因型频率在各组不同性别者及两组同性别者间比较,差异也无统计学意义(P＞0.05).(3)联合基因型频率:夫妇联合基因型GG+ GG、GG+AG、GG+AA、AG+ AG、AG+AA、AA+AA频率URSA组分别为1.0％(2/200)、2.5％ (5/200)、6.0％(12/200)、20.0％(40/200)、38.0％ (76/200)、32.5％ (65/200)；对照组分别为0、1.3％(1/76)、2.6％ (2/76)、17.1％ (13/76)、42.1％(32/76)、36.8％ (28/76)；两组夫妇联合基因型比较,差异也无统计学意义(P＞0.05).结论 MTRR A66G位点多态性与URSA的发生无明显相关性,不是URSA的遗传易感基因.
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下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌SKOV3细胞体内外生物学特性的影响
目的：探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）SKOV3/DDP细胞体内外生物学特性的影响。方法（1）MTRR基因下调的SKOV3/DDP细胞系的构建及鉴定：设计4个针对MTRR基因不同靶序列的短发夹状RNA（shRNA），分别为U6-GFP-Neo-homo-1106、U6-GFP-Neo-homo-1931、U6-GFP-Neo-homo-419、U6-GFP-Neo-homo-1460，蛋白印迹（western blot）法筛选干扰效果好的针对MTRR基因的shRNA连接至pSicoR质粒，建立重组慢病毒干扰载体（即pSicoR-1106）并感染SKOV3/DDP细胞，流式细胞仪筛选稳定转染的细胞，逆转录（RT）-PCR技术及western blot法验证转染后细胞中MTRR mRNA和蛋白的表达。（2）体外实验：实验分为3组，重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106、阴性对照质粒pSicoR-NC及包装质粒采用脂质体法分别转染肾上皮细胞系293T细胞，所得病毒上清液感染SKOV3/DDP细胞，所得感染后细胞即为下调MTRR基因的SKOV3/DDP-MTRRi细胞（SKOV3/DDP-MTRRi组）以及阴性对照SKOV3/DDP-NC细胞（SKOV3/DDP-NC组，作为阴性对照）和未转染的SKOV3/DDP细胞（SKOV3/DDP组，作为空白对照）。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定3组细胞的生长情况及其对顺铂的耐药性[以50%抑制浓度（IC50）表示]；不同浓度（0、1、2、4μg/ml）的顺铂作用后，克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成情况，流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期比例。（3）体内实验：将上述3组细胞接种于裸鼠的腹股沟皮下，建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。以2.5 mg/kg顺铂腹腔注射（每2天1次，共21次）后，观察3组（每组8只）裸鼠移植瘤的生长情况，采用免疫组化SP法检测3组裸鼠移植瘤组织中MTRR、细胞增殖相关核抗原（Ki-67）蛋白的表达。结果（1）western blot法筛选的干扰效果好的针对MTRR基因的shRNA为U6-GFP-Neo- homo-1106，以此建立重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106，转染SKOV3/DDP细胞后，其MTRR mRNA和蛋白的表达明显减弱，证实下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞系构建成功。（2） MTT比色法检测显示，第5天开始，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞的生长速度明显慢于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3/DDP组（P<0.05）；SKOV3/DDP-MTRRi组、SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组细胞对顺铂的IC50分别为4.01、7.90、8.91μg/ml，SKOV3/DDP-MTRRi组明显低于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3/DDP组（P<0.05）。不同浓度（0、1、2、4μg/ml）的顺铂作用后，克隆形成实验检测显示，各浓度下SKOV3/DDP-MTRRi组克隆形成个数均明显少于SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组（P<0.05）；流式细胞仪检测显示，当顺铂浓度为4μg/ml时，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞的G0/G1期比例为（72.8±5.0）%，明显高于SKOV3/DDP-NC组及SKOV3/DDP组[分别为（64.4±2.5）%、（64.3±3.0）%，P<0.05]。（3）裸鼠腹腔内注射顺铂6周后，SKOV3/DDP-MTRRi组、SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组裸鼠移植瘤的体积分别为（97±32）、（168±45）、（173±32）mm3，移植瘤质量分别为（0.36±0.17）、（1.08±0.17）、（1.11±0.20）g， SKOV3/DDP-MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组（P<0.05）。3组移植瘤组织中，MTRR蛋白的阳性表达率分别为2/8、5/8、7/8，Ki-67蛋白的阳性表达率分别为1/8、6/8、7/8， SKOV3/DDP-MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组（P<0.05）。结论 MTRR基因表达下调后在体内外均能降低顺铂耐药的卵巢癌SKOV3/DDP细胞的增殖能力，并增加其对顺铂的敏感性。
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下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究
目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法（1）实验分为3组：下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞（SKOV3/DDP-MTRRi组）、转染阴性对照（NC）序列的SKOV3/DDP细胞（SKOV3/DDP-NC组，作为阴性对照）、未转染的SKOV3/DDP细胞（SKOV3/DDP组，作为空白对照）。不同浓度（0、1、2、4μg/ml）顺铂作用后，采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率，免疫荧光法检测3组细胞的自噬现象，蛋白印迹（western blot）法检测3组细胞中自噬标志分子自噬微管相关蛋白轻链3β（LC3B）、p62蛋白的表达，透射电镜观察3组细胞中自噬体的形成情况。（2）雷帕霉素诱导后SKOV3/DDP-MTRRi细胞自噬及凋亡情况变化的检测，实验分为4组，雷帕霉素组（5 nmol/L雷帕霉素处理）、雷帕霉素+顺铂组（5 nmol/L雷帕霉素+4μg/ml顺铂处理）、顺铂组（4μg/ml顺铂处理）、空白对照组，采用western blot法检测4组细胞中自噬标志分子LC3B、p62蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测4组细胞的生存率，流式细胞仪检测4组细胞的凋亡率。（3）4μg/ml顺铂作用48 h后，western blot法检测3组（即SKOV3/DDP-MTRRi组、SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组）细胞中凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）和Bcl-2家族以及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）自噬通路关键蛋白的表达。结果（1）不同浓度（0、1、2、4μg/ml）顺铂作用48 h后，随着顺铂浓度的增加，3组细胞的凋亡逐渐增加，当顺铂浓度达到2μg/ml时，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞的凋亡率[（26.2±1.4）%]明显高于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3/DDP组[分别为（14.8±2.4）%、（14.2±2.4）%；P<0.05]；免疫荧光法检测显示，随着顺铂浓度增加，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中LC3B蛋白在细胞质内聚集成团，明显多于SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组；且与SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组比较， SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中LC3B蛋白表达水平明显降低（P<0.05），p62蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；当顺铂浓度达到4μg/ml时，SKOV3/DDP组和SKOV3/DDP-NC组细胞内的细胞器结构完整，有少量自噬线粒体出现；而SKOV3/DDP-MTRRi组细胞内的细胞器结构消失，空泡明显增多，且没有观察到自噬体的形成。（2）与雷帕霉素组、顺铂组及空白对照组相比，雷帕霉素+顺铂组SKOV3/DDP-MTRRi细胞中LC3B蛋白的表达水平（分别为1.43±0.04、1.37±0.11、1.11±0.09、1.72±0.08）明显升高（P<0.05），p62蛋白的表达水平（分别为0.94±0.12、1.21±0.11、1.57±0.10、0.58±0.10）明显降低（P<0.05）；与顺铂组比较，雷帕霉素+顺铂组SKOV3/DDP-MTRRi细胞的生存率[分别为（0.62±0.03）%、（0.78±0.03）%]明显升高（P=0.018），凋亡率[分别为（59.0±3.9）%、（40.4±3.0）%]明显降低（P=0.019）。（3）4μg/ml顺铂处理48 h后，与SKOV3/DDP-NC组、SKOV3/DDP组比较，SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中Bcl-2家族成员Bax蛋白的表达水平无明显变化（P=0.661），而Bcl-2蛋白的表达水平明显降低（P=0.030）；caspase家族成员caspase-3、caspase-7、caspase-9、多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（PARP）蛋白的表达水平无明显变化（P>0.05），而裂解的caspase-3、caspase-7、caspase-9、PARP蛋白的表达水平均明显升高（P<0.05）。SKOV3/DDP-MTRRi组细胞中PI3K/Akt自噬通路关键蛋白细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）蛋白的表达水平显著升高（P<0.05），而第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）蛋白的表达水平显著下降（P<0.05）。结论顺铂诱导可使MTRR基因下调的顺铂耐药卵巢癌细胞的凋亡增加、自噬减弱，其可能机制为通过调节caspase和Bcl-2凋亡家族蛋白以及PI3K/Akt自噬通路中关键蛋白的表达，从而增加细胞对顺铂的敏感性。
