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小干扰RNA对小鼠淋巴细胞cbl-b基因表达的抑制作用
目的 设计合成及筛选自身免疫关键基因--cbl-b (Casitas B-cell lineage lymphoma-b,cbl-b)基因小分子干扰RNA(siRNA).方法 应用RNA设计软件,模拟cbl-b小鼠cbl-b mRNA二级结构,设计并合成针对cbl-b mRNA的4对21核苷酸(nt)siRNA,96孔板转染小鼠淋巴细胞,以空白及转染非特异siRNA(与cbl-b mRNA无同源性的21nt siRNA)作为对照,应用蛋白免疫印迹(Western blot)方法 检测小鼠淋巴细胞cbl-b蛋白表达.结果 cbl-b基因siRNA工作浓度为100nmol/L时转染小鼠淋巴细胞转染率高,可达(87.48±1.94)%,平均荧光强度强,可达33.09±1.77.与对照相比,转染cbl-b siRNA的小鼠淋巴细胞蛋白表达明显下调,以siRNA-4显著,抑制率达85%,转染非特异性siRNA的小鼠淋巴细胞cbl-b蛋白表达水平无明显变化.结论 得到cbl-b siRNA转染小鼠淋巴细胞佳转染条件,成功筛选能高效抑制cbl-b蛋白表达的siRNA-4,其有效抑制时间约为48h,有望通过沉默cbl-b基因直接活化淋巴细胞,增强机体主动免疫杀伤肿瘤细胞.
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特异性小干扰RNA沉默Cbl-b基因增强小鼠脾脏T淋巴细胞的免疫活性
目的 观察特异性小干扰RNA (siRNA)沉默Cbl-b基因对于小鼠脾脏T淋巴细胞免疫活性影响.方法 尼龙毛柱法分离T淋巴细胞,加入抗CD3抗体(1 mg/L)在体外模拟T淋巴细胞活化的第一信号,脂质体转染12、24、48 h后,流式细胞仪检测早、中、晚期活化标志分子CD69、CD25、CD71的表达变化；转染48 h后细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒检测T淋巴细胞增殖程度.结果 利用特异性Cbl-b siRNA能有效沉默T淋巴细胞Cbl-b基因,转染12 h后,转染组、对照组、空白组CD69分子表达阳性率分别为(46.78±4.89)％、(21.36±2.06)％、(25.09±2.27)％(P＜0.01)；转染24h后,转染组、对照组、空白组CD25分子表达阳性率分别为(19.27±1.84)％、(8.18±0.71)％、(9.25±0.65)％(P＜0.01)；转染48 h后,转染组、对照组、空白组CD71分子表达阳性率分别为(43.26 ±3.89)％、(23.99 ±1.97)％、(28.09 ±2.15)％ (P ＜0.01)；转染48 h后,CCK-8试剂盒检测转染组、对照组、空白组吸光度值分别为0.763±0.063、0.356±0.039、0.383±0.015(P＜0.01).结论 利用特异性小干扰沉默Cbl-b基因能够增强小鼠脾脏T淋巴细胞免疫活性.
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瘤体注射Cbl-b基因真核表达质粒转染T淋巴细胞免疫治疗小鼠前列腺癌
目的 瘤体注射Cbl-b基因真核表达质粒[短发卡RNA (shRNA)-Cbl-b]转染T淋巴细胞,观察前列腺癌小鼠肿瘤生长及机体免疫水平变化.方法 尼龙毛柱法提取小鼠脾脏T淋巴细胞,质粒转染shRNA-Cbl-b至T淋巴细胞；瘤体注射shRNA-Cbl-b T淋巴细胞至RM-1前列腺癌小鼠肿瘤部位,每周1次,共4次；Western blot法检测荷瘤小鼠肿瘤组织中Cbl-b蛋白的表达,测量小鼠肿瘤体积变化；酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠外周血中的白细胞介素(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-β (TNF-β)水平变化.结果 与阴性对照组和空白组比较,瘤体注射shRNA-Cbl-b T细胞能降低肿瘤组织Cbl-b蛋白表达,显著抑制小鼠前列腺肿瘤生长(P＜0.05)；shRNA-Cbl-b组、阴性对照组、空白组外周血中IL-2浓度分别为(560.34 21.29)、(447.05 20.11)、(445.12 ±15.06) ng/L(P＜0.05),IFN-γ浓度分别为(435.70±22.25)、(403.37 ±7.15)、(380.02±14.43) ng/L(P＜0.05),TNF-β浓度分别为(306.81 ±9.71)、(253.15 ±9.34)、(253.38±15.67) ng/L(P ＜0.05).结论 瘤体注射shRNA-Cbl-b T淋巴细胞能抑制小鼠前列腺肿瘤的生长,提高外周血IL-2、IFN-γ、TNF-β等细胞因子分泌水平,增强了小鼠机体抗前列腺肿瘤免疫.
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c-Cbl、Cbl-b和EGFR在胃癌组织中的表达及其临床意义
背景与目的:c-Cbl和Cbl-b是CBL(the Casitas B-cell lymphoma)家族的两个重要成员.具有连接体功能及E3泛素连接酶功能,在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)下调过程中发挥重要作用.本研究旨在探讨c-Cbl、Cbl-b和EGFR在胃癌组织中的表达及其1临床意义.方法:将124例胃癌术后标本和16例癌旁正常胃组织制作成组织芯片,应用免疫组化方法检测c-Cbl、Cbl-b和EGFR的表达情况,并分析其与l临床及病理因素的关系.结果:124例胃癌中c-Cbl、Cbl-b和EGFR的阳性率分别为71.0%、82.3%和56.5%,均显著高于癌旁正常胃组织(分别为18.0%、25.0%和12.5%,均P<0.01).c-Cbl表达与浸润深度及病理分期呈正相关(r=0.219,P=0.015和r=0.266,P=0.003);Cbl-b表达与淋巴结转移及病理分期呈正相关(r=0.190,P=0.034和r=0.298,P=0.001);EGFR表达与浸润深度及病理分期呈正相关(r=0.286.P=0.001和r=0.362,P=0.000).c-Cbl、Cbl-b与EGFR表达强度均呈正相关(r=0.241,P=0.007和r=0.183,P=0.042).27例胃癌标本同时强阳性表达c-Cbl、Cbl-b和EGFR,多为分化程度差、肿瘤组织浸润程度深、淋巴结转移数目多及分期晚的病例.结论:c-Cbl、Cbl-b和EGFR的高表达与胃癌的侵袭和发展有关,c-Cbl和Cbl-b有可能成为胃癌新的分子标志物.
关键词： c-CBL Cbl-b 表皮生长因子受体(EGFR):胃癌 -
c-Cbl、Cbl-b和EGFR在非小细胞肺癌中的表达及其预后价值
背景与目的 表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)与肺癌的发展密切相关,其功能受泛素连接酶 (Casitas B-lineage lymphoma,Cbl)家族调节,本研究旨在探讨c-Cbl、Cbl-b和EGFR在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及其在预后判断方面的应用价值.方法 采用组织微阵列联合免疫组织化学染色技术检测94例NSCLC组织中c-Cbl、Cbl-b、EGFR的表达,分析其与临床病理因素及预后之间的关系.结果 c-Cbl、Cbl-b和EGFR的阳性表达率分别为30.9%(29/94)、84.0%(79/94)和60.6%(57/94).c-Cbl、Cbl-b蛋白表达与年龄、病理类型、TNM分期、淋巴结有无转移及吸烟史无关.EGFR、c-Cbl、Cbl-b的表达与患者的总生存无明显相关.亚组分析显示,在EGFR阳性组患者中,c-Cbl阳性组患者的总生存期(overall survival,OS)明显优于c-Cbl阴性组的患者(P=0.014).结论 检测c-Cbl蛋白的表达水平可能有助于预测EGFR阳性NSCLC患者的预后.
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促炎分子盘状结构域受体2在泛素化修饰过程中与泛素分子的偶联方式
目的 研究泛素分子中哪些位点的赖氨酸(Lys)残基参与了具有促炎效应的膜受体盘状结构域受体2(DDR2)的多聚泛素化修饰.方法 将DDR2、Cbl-b及泛素分子不同位点Lys的突变体共转染HEK293T细胞,以胶原蛋白刺激细胞诱导DDR2发生活化.利用免疫沉淀方法分离细胞中的DDR2,Western blot法检测DDR2与不同泛素分子的偶联情况.结果 仅保留27位Lys的泛素分子偶联到DDR2分子上的能力与野生型泛素分子相接近,保留33位Lys的泛素分子有较微弱与DDR2偶联的能力.27位Lys突变可使泛素分子彻底丧失与DDR2相偶联的能力,而33位Lys突变使得泛素分子偶联DDR2的能力部分丧失.结论 Cbl-b介导的DDR2的多泛素化修饰主要是通过泛素分子的Lys27偶联的,Lys33可能也部分参与了DDR2的泛素化修饰.
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多发性骨髓瘤患者外周血单个核细胞c-Cbl和Cbl-b基因表达下调
目的 研究多发性骨髓瘤(MM)患者外周血单个核细胞(PBMC)中c-Cbl和Cbl-b基因表达情况.方法 收集23例MM患者和22例健康人PBMC,利用SYBR(R) Green实时荧光定量PCR方法检测MM患者和健康人PBMC中c-Cbl和Cbl-b基因相对表达水平；利用RT-PCR方法分别扩增MM患者和健康人c-Cbl基因第7～10外显子,并对PCR产物进行序列分析.结果 MM组c-Cbl表达水平(中位数0.798％),与健康对照组c-Cbl表达水平(中位数2.443％)相比,显著降低(P＜0.05)；Cbl-b表达水平(中位数0.714％)与健康对照组Cbl-b表达水平(中位数2.179％)比较,也显著降低(P＜0.05).在2例MM患者中检测到c-Cbl基因第7～10外显子存在2个大小不同的片段:483 bp和148 bp,分别为野生型c-Cbl和删除突变的c-Cbl基因,所有PCR产物测序后均未发现突变.结论 MM患者PBMC中c-Cbl和Cbl-b基因表达下调.
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Cbl-b调控T细胞的免疫耐受
免疫系统是一个复杂的有机整体,作为调控免疫耐受的分子之一,Cbl-b主要通过诱导T细胞无能与调控性T细胞来负调控免疫作用.本综述旨在阐述Cbl-b负调控免疫作用的具体机制,以及其自身的表达调控机制,以此找到一个新颖且重要的疾病治疗方向.
