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STAT5A基因表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡影响的观察
目的:研究抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响,为其作为肝癌基因治疗的新分子靶点提供实验依据,并对RNAi实验方法的优化进行探讨.方法:构建2个针对STAT5A基因不同位点的RNA干扰(RNAi)真核表达载体,为减少脱靶效应和细胞毒性,采用两载体共转染的方法转染人肝癌细胞HepG2,分别采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后细胞中STAT5A mRNA和蛋白表达的变化；采用MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:酶切及测序结果显示,STAT5A基因两位点的shRNA表达载体均构建成功；两载体共转染HepG2细胞48 h后,与对照组相比,RT-PCR结果显示实验组细胞中STAT5A mRNA的抑制率约为66％,P＜0.05；蛋白质印迹法检测结果显示,STAT5A蛋白的抑制率约为58％,P＜0.05；同时MTT法显示实验组较对照组在转染后24～96 h内细胞生长速度减慢、增殖抑制明显(P＜0.05),流式细胞仪检测实验组细胞凋亡率为(34.68±0.78)％,明显高于阴性对照组(5.12±1.09)％和空白组(4.75±1.65)％,P＜0.05.结论:成功构建了针对STAT5A基因的RNA干扰真核表达载体,两载体共转染可有效抑制STAT5A基因的表达,并能抑制细胞生长、诱导细胞凋亡.
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STAT5A基因有效siRNA序列的筛选及其对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响
目的 筛选针对STAT5A基因有效的siRNA,研究抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨STAT5A基因在肝癌发生发展中的作用.方法 设计并化学合成针对STAT5A基因三个靶点的siRNA,采用脂质体法转染人肝癌细胞HepG2,分别用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染后HepG2细胞STAT5A mRNA和蛋白表达的变化,从中筛选出一段干扰效率显著的siRNA;用该siRNA转染HepG2细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 三段STAT5A基因的siRNA均对HepG2细胞中STAT5A mRNA和蛋白表达产生了不同程度的抑制作用,其中以siRNA-3697的干扰效率高,STAT5A mRNA和蛋白的表达抑制率分别为72.03％和66.27％(P＜0.05);转染后1～4d细胞生长速度减慢、增殖显著抑制(P＜0.05);转染后48 h细胞凋亡率为37.33％(P＜0.05).结论 成功筛选出针对STAT5A基因有效的siRNA;该siRNA可特异地阻断HepG2细胞STAT5A基因的表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡.
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抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制研究
目的:研究抑制STAT5A基因的表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响,并对其影响肝癌细胞增殖的机制进行探讨,为STAT5A基因在肝细胞癌中的功能研究提供实验依据.方法:构建针对STAT5A基因的shRNA真核表达载体,脂质体法转染人肝癌细胞HepG2,采用半定量RT-PCR的方法检测细胞中STAT5A mRNA的变化；蛋白质印迹技术检测转染前后细胞中STAT5A蛋白、细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白表达的变化；采用MTT法检测细胞增殖的情况.结果:酶切及测序结果显示shRNA表达载体均构建成功,转染HepG2细胞48h后,与对照组相比,RT-PCR结果显示实验组细胞中STAT5AmRNA的抑制率为72.03％ (P＜0.05),蛋白质印迹法显示STAT5A蛋白的抑制率为66.27％(P＜0.05),细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白表达下降47.16％(P＜0.05),同时MTT法显示细胞生长速度减慢、增殖抑制明显.结论:抑制STAT5A基因的表达可有效抑制HepG2细胞的增殖,其机制可能是通过下调Cyclin D1的表达实现的.
