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TEAD4对结直肠癌细胞增殖影响及机制探讨
目的 结直肠癌国内外高发,是肿瘤死亡的主要病因之一.TEAD4是YAP/TAZ信号通路中的关键因子.本研究旨在探讨敲低TEAD4的表达后对结直肠癌细胞增殖的影响和机制.方法 通过在结直肠癌细胞系Caco2和HT-29中通过转染TEAD4siRNA和感染慢病毒,以达到瞬时或稳定敲低TEAD4的目的,利用蛋白质印迹方法检测转染效率及相关蛋白的表达.用SRB法分别检测敲低TEAD4后Caco2和HT-29细胞的存活率,以及使用EdU掺入法测定细胞DNA合成效率.结果 在肠癌细胞中使用TEAD4的siRNA,瞬时敲低TEAD4的表达48 h后,蛋白质印迹法检测结果提示,与对照组相比,Caco2(F-99.22,P＜0.001)和HT-29(F=167.3,P＜0.001)细胞中的TEAD4蛋白水平显著降低,同时观察到Caco2(F=45.78,P＜0.001)和HT-29(F=40.71,P＜0.001)细胞中p27蛋白的表达量有明显的上升,蛋白表达差异有统计学意义.SRB结果显示,使用shRNA慢病毒载体稳定敲低肠癌细胞中TEAD4的表达,与对照组细胞相比,2d沉默TEAD4基因的Caco2 (F=142.9,P＜0.001)和HT-29(F=141.0,P＜0.001)细胞的生长速度变慢;于3d后这种抑制作用更加明显,Caco2 (F=394.5,P＜0.001)和HT-29(F=305.1,P＜0.001)细胞增殖速度明显变慢.使用EdU掺入法检测敲低TEAD4后对Caco2和HT-29细胞DNA合成的影响,结果显示,Caco2和HT-29细胞,Caco2/Consi、Caco2/TEAD4si#2、Caco2/TEAD4si#3、HT-29/Consi、HT-29/ TEAD4si#2、HT-29/ TEAD4si#3的DNA合成率分别为(43.20±2.18)％、(27.19±2.34)％和(30.14±1.02)％及(28.23±3.11)％、(11.89±1.20)％和(17.91±2.23)％,干扰组Caco2/TEAD4si# 2(P=0.001)、Caco2/TEAD4si# 3(P＜0.001)、HT-29/TEAD4si# 2(P=0.001)及HT-29/TEAD4si# 3(P=0.011)细胞的DNA合成率显著低于对照组细胞,说明在Caco2和HT-29细胞中敲低TEAD4后,DNA的合成明显受到了抑制.结论 敲低TEAD4对结直肠癌细胞体外增殖和DNA的合成有抑制作用,可能部分通过上调p27的表达,TEAD4可能是结直肠癌发生、发展中潜在的临床诊断或治疗新靶点.
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FKBP12蛋白RNA干扰与回复表达细胞系的建立
目的 建立FKBP12蛋白(FK506 binding-protein 12,基因名FKBP1A)RNA干扰和回复表达的人肺癌细胞系A549,并初步探索FKBP12的功能.方法 设计3条核心序列位于FKBP1A 3 'UTR区域的siRNA,它们仅靶向内源性的FKBP12.利用pLKO.1-puro载体包装相应的shRNA慢病毒感染A549,得到FKBP12表达调低的细胞系.使用带neo基因筛选标记的pcDNA3.1载体回复表达FKBP12,并筛选得到不受shRNA干扰的回复表达细胞系.用实时荧光定量PCR和Western blotting检测调低和回复表达效果,并初步分析细胞系表型.结果 FKBP12在mRNA和蛋白质水平上的表达均被抑制,干扰效率在75％以上(P＜0.01).FKBP12不影响A549的细胞形态和增殖效率,而下调mTORC1(mammalian target of Rapamycin complex 1)下游转录调控相关蛋白4E-BP1 (eIF4E-binding protein 1)的表达.结论 成功构建了FKBP12蛋白敲低和回复表达的A549细胞系,为后续探究FKBP12的功能奠定了基础.
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多发性骨髓瘤细胞中SWI/SNF核心亚单位SNF5调控的基因表达谱分析
目的 研究染色质重塑复合物SWI/SNF核心亚单位SNF5对骨髓瘤细胞系基因表达谱的调控作用.方法 在KM3细胞中构建四环素诱导的表达SNF5 siRNA的稳定细胞系,通过四环素诱导敲低SNF5,检测SNF5敲低前后的基因表达谱,对差异表达基因进行生物信息学分析,并对部分基因进行验证.结果 SNF5敲低抑制KM3细胞生长,基因表达谱分析发现545个表达差异基因,其中214个上调,331个下调.结论 SNF5是多发性骨髓瘤细胞生长所需的,它通过影响与细胞生长及凋亡相关基因的表达来发挥作用.
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敲低赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)促进人诱导性多能干细胞分化为产胰岛素细胞
目的 探索一种人诱导性多能干细胞(hiPSC)体外高效分化为产胰岛素细胞(IPC)的诱导方案.方法 RNAi技术敲低hiPSC赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)基因后,利用四步法诱导其体外分化为IPC.流式细胞术分析IPC分化效率,实时定量PCR检测细胞LSD1、POU5同源盒转录因子1(OCT4)、Y染色体性别决定区因子17 (SOX17)、叉头盒蛋白A2(FOXA2)、胰腺和十二指肠同源盒蛋白1(PDX1)、配对盒转录因子4(PAX4)、PAX6、肝细胞核因子6(HNF6)、肝细胞核因子1同源盒蛋白A(TCF1)、NK6同源盒蛋白1(NKX6.1)、葡萄糖转运子2(GLUT2)、葡萄糖激酶(GK)、胰岛素及MAF bZIP转录因子A(MAFA)的mRNA水平,免疫荧光技术检测细胞PDX1、胰岛素的表达和定位;双硫腙(DTZ)染色和透射电镜分别观察细胞内胰岛素的分泌和分泌颗粒分布情况;ELISA检测诱导后细胞胰岛素和C肽分泌量.结果 LSD1敲低组的IPC分化效率较对照组有明显提高,胰岛β细胞发育相关基因SOX17、PDX1、PAX4、胰岛素的mRNA表达显著上调.LSD1敲低组的IPC共表达成熟β细胞特异性蛋白PDX1和胰岛素.另外,这些IPC能感应葡萄糖刺激并以胰岛素分泌小泡形式释放胰岛素,胰岛素或C肽释放量约为天然胰岛细胞的1/6(而对照组仅为1/8).结论 敲低LSD1基因可以促进hiPSC体外高效分化为IPC.
