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有丝分裂阻滞缺陷蛋白2选择性剪接体MAD2β在胃癌细胞多药耐药机制中的作用
目的观察有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient protein 2, MAD2)基因的选择性剪接体MAD2β在人胃癌多药耐药性形成过程中的作用机制.方法从耐阿霉素人胃癌细胞系SGC7901/ADR中提取总RNA,通过RT-PCR获得MAD2β全长编码cDNA,并克隆至pUCm-T载体,正向亚克隆插入真核表达载体pcDNA3.1中.以脂质体介导pcDNA3.1/MAD2β真核表达载体转染胃腺癌细胞SGC7901.以体外药敏试验检测转染MAD2β的胃癌细胞及其对照组细胞对化疗药物的敏感性.通过流式细胞仪检测MAD2β基因转染组和对照组胃癌细胞在细胞周期中的分布和细胞内阿霉素的荧光强度.结果 RT-PCR扩增获得约0.53 kb片段,DNA序列测定证实为MAD2的一种选择性剪接形式,命名为MAD2β.重组正义真核表达载体pcDNA3.1/MAD2β瞬时转染SGC7901细胞,经MTT法证实,转染细胞SGC7901/MAD2β对化疗药物阿霉素、长春新碱和丝裂霉素的耐药性增强.与SGC7901/pcDNA3.1比较,阿霉素大剂量短期作用后,SGC7901/MAD2β细胞内的平均荧光强度比对照组低(P<0.05).结论 MAD2β基因在一定程度上增强了人亲本胃癌细胞SGC7901对化疗药物的耐受性,其可能的机制为肿瘤细胞在化疗药物作用下,有丝分裂出现异常,耐药细胞通过调控MAD2基因产生不同的选择性剪接形式, 降低MAD2的活性或改变其功能,以通过纺锤体检测点并继续存活.
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RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响
目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响.方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期.结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达.HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%.有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多.结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础.
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沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响
目的:研究沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响.方法:采用RT-PCR和Western印迹法筛选MAD2基因在7种结肠癌细胞中的高表达细胞株,并用siRNA瞬时转染以降低MAD2表达,随后采用CCK-8法检测结肠癌细胞增殖能力.流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,transwell实验评估转染后结肠癌细胞迁移能力的改变.结果:SW1116细胞在mRNA和蛋白水平均呈现高表达MAD2,转染靶向MAD2的siRNA可显著降低MAD2在SW1116细胞中的表达.下调MAD2后,SW1116细胞的增殖能力较对照组有明显下降(P＜0.05).干扰siRNA组细胞凋亡比例较对照组增加,而细胞周期未见统计学差异.transwell实验中,siRNA干扰组穿膜细胞数为(45±2)个,显著低于阴性对照组[(1 85±5)个]和空白对照组[(195±5)个](P＜0.01).结论:SW1116高表达MAD2基因,沉默MAD2基因显著降低肠癌细胞增殖,诱导凋亡,并抑制细胞迁移.MAD2基因很可能成为新的预防结肠癌转移的目的基因.
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MAD2基因沉默促进人食管鳞癌细胞系KYSE30细胞增殖和侵袭能力的实验研究
背景与目的:有丝分裂检测点缺陷可引起细胞染色体不稳定性而使细胞生物学行为改变,本实验探讨RNA干扰有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2,MAD2)基因表达对人食管鳞癌细胞系KYSE30细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:利用脂质体转染的方法,将MAD2基因的siRNA转染食管鳞癌细胞KYSE30,并通过RT-PCR以及免疫印迹的方法进行siRNA效果鉴定.实验分为正常对照组、非特异干扰组、特异干扰组.MTT、克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,损伤刮擦实验和Transwell小室实验分别检测转染细胞株的迁移与侵袭能力.结果:siRNA作用48 h组,MAD2蛋白的表达低;相应地,迁移黏附能力增强,侵袭实验显示转染后细胞侵袭能力较转染前有显著加强.结论:MA4D2基因沉默能够促进人食管鳞癌细胞系KYSE30的体外增殖和侵袭能力增强,并抑制凋亡,提示其变化对肿瘤的发生和转移发挥重要作用.
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MAD2和p27在大肠癌组织中的表达及意义
目的 探讨MAD2和p27表达与大肠癌发生、发展的关系.方法 采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法,检测大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中MAD2表达,并对大肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序.同时应用免疫组织化学方法检测大肠癌和正常组织中p27表达情况.结果 大肠癌组织中MAD2阳性表达率明显高于腺瘤和正常大肠黏膜组织(66.7% vs 39.6%vs 22.9%),三者间比较差异均有统计学意义(P＜0.01). MAD2表达与大肠癌肿瘤分化和患者无瘤生存时间有关(P＜0.05).大肠癌组织中未见MAD2基因突变.正常大肠黏膜组织中p27阳性表达率为81.3%,大肠癌中其阳性表达率为41.7%,两者比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MAD2和p27基因表达与大肠癌的发生及发展有关.MAD2可能是大肠癌预后的1个重要指标.
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微小RNA抑制胚胎细胞MAD2基因的表达
目的:探讨微小RNA(microRNA)抑制胚胎细胞MAD2基因表达的机理.方法:用定量real-time PCR比较microRNA转染前后的胚胎细胞内源性基因MAD2 mRNA表达水平,同时用western blot比较转染前后Mad2蛋白的表达水平.结果:对照组的MAD2基因mRNA拷贝数/GAPAH mRNA拷贝数为0.1780±0.0688,而转染microRNA重组质粒后,实验组的mRNA比值分别为0.1778±0.0689和0.1778±0.0670,经统计分析,两实验组细胞的内源性MAD2基因mRNA水平与对照组无显著性差异;而其中一实验组的蛋白水平在转染后有明显降低.结论:microRNA主要在翻译水平调节哺乳动物细胞内基因的表达,为研究基因表达的调控机制奠定了良好的基础.
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细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达
目的:构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法:通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列.将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光.结果:成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系.
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胚胎细胞MAD2基因表达对染色体分离的影响
目的探讨MAD2基因表达对染色体分离的影响.方法用定量RT-PCR比较RNA干扰前后的胚胎细胞内源性基因MAD2 mRNA表达水平,同时对染色体数目异常率进行比较分析.结果干扰后MAD2基因mRNA拷贝数/GAPDH基因mRNA拷贝数的均值为干扰前的20%,染色体数目异常率均值由干扰前的4.702%上升到28.498%.经统计学分析,RNA干扰后MAD2基因mRNA水平显著下降,染色体数目异常率显著增高.结论MAD2基因表达的降低会导致染色体分离的异常,本研究为染色体分离相关蛋白功能研究建立了新的研究手段和实验评价体系.
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MAD2蛋白在人正常组织和胃癌组织中的表达
目的:研究MAD2蛋白在人正常组织和胃癌中的表达及其临床意义.方法:用免疫组织化学方法检测23例人正常组织及102例胃癌及癌旁组织中MAD2蛋白的表达.结果:MAD2蛋白在23例正常组织中主要定位在胞核和胞浆中,在正常胃组织主要定位在胞浆,在胃癌组织中主要定位在胞核和胞浆.MAD2在胃癌中和癌旁组织的表达阳性率分别为70.59%(72/102)和38.24%(39/102),两者差异具有统计学意义(P<0.001).MAD2蛋白表达与肿瘤组织分化程度呈负相关,与淋巴结转移呈正相关(P<0.001).结论:MAD2蛋白在细胞有丝分裂监测点中发挥重要作用,其亚细胞定位在胃癌形成中发生变化,MAD2表达在胃癌发生过程中具有重要作用,对其检测有助于胃癌恶性程度评价和预后判断.
关键词： 有丝分裂纺锤体监测点 MAD2基因 人正常组织 免疫组织化学 染色体不稳定性
