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黄苓苷对HaCaT细胞影响的蛋白组学研究
目的 本研究旨在观察黄苓苷对永生化人表皮角质形成细胞HaCAT株差异表达蛋白的影响.方法 培养HaCaT细胞,并加入黄苓苷进行干预.培养24h后收集细胞总蛋白,利用双向电泳方法分离细胞蛋白质,并用ImageMaster图像分析软件比较各组细胞的蛋白质图谱,筛选出的差异蛋白质点应用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质量指纹图谱,然后利用Mascot查询软件搜寻Swiss Prot数据库鉴定蛋白质.结果 黄苓苷使HaCaT细胞蛋白质组发生改变,对其中18个差异蛋白质点进行质谱分析,获得15个点的肽质量指纹图,初步鉴定为热休克蛋白beta-1,肌动蛋白、二氢嘧啶酶调节蛋白2等.结论 黄苓苷可通过影响细胞中多种蛋白的表达,增强细胞的稳态和抵抗环境刺激损伤的能力,发挥抗肿瘤活性.
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皮肤细胞蛋白质组质谱分析方法的建立及肽质量指纹图谱的构建
目的 建立人皮肤细胞蛋白质组学研究所需的质谱分析方法,并获得皮肤细胞蛋白质肽质量指纹图谱.方法体外培养人皮肤成纤维细胞与角质形成细胞,采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离其总蛋白质,凝胶经染色后,在图谱上选取2个角质形成细胞蛋白点与1个成纤维细胞蛋白点,进行胶内酶切、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析鉴定.结果获得3个点的肽质量指纹图谱,经Mascot软件搜索人非冗余蛋白质数据库后,鉴定为细胞骨架Actin gamma1、tubulinα2及热休克蛋白HSP70.结论 皮肤细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析技术的建立为皮肤蛋白质组学的进一步研究提供手段.
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肽质量指纹图谱中实验因素引起的氨基酸修饰以及相应肽段的质量变化
目的:肽质量指纹图谱是蛋白质组研究中重要的蛋白鉴定手段之一,而氨基酸残基的化学修饰会导致图谱中肽质量的改变.本文对实验性因素可能引起的这种质量改变进行了较为系统的观察和小结.方法:本文分析了多个标准蛋白基于SDS-PAGE分离的肽质量指纹图谱的实验结果,综合报道由各种实验因素引起的氨基酸残基体外化学修饰以及相应的肽质量变化.结果:这些化学修饰至少包括:①半胱氨酸残基丙烯酰胺加合物生成或乙酰基烷基化修饰,相应的肽段质量数分别增加71.04和57.02;②甲硫氨酸残基的氧化修饰,相应肽段质量数增加15.99(单甲硫氨酸氧化)或其倍数(多甲硫氨酸氧化); ③酸性氨基酸残基的成盐反应,相应肽段质量数增加21.98(加钠盐)或37.95(加钾盐); ④酸性氨基酸残基的酯化反应,相应肽段质量数增加14.03(甲醇固定)或28.03(乙醇固定); ⑤碱性氨基酸(赖氨酸)残基与甲醛发生西佛碱反应,相应肽段质量数增加27.99.以上各种氨基酸的体外修饰,以甲硫氨酸的氧化修饰为常见;酸性氨基酸的酯化反应通常发生在蛋白固定步骤;碱性氨基酸(赖氨酸)的西佛碱反应是由于蛋白质银染时增色剂甲醛的引入.特别注意的是,某些肽段可以同时发生多种化学修饰,使得肽质量指纹图谱的解析复杂化.结论:以上实验因素引起的氨基酸修饰以及相应的肽质量变化在蛋白质数据库检索和蛋白质鉴定时必须加以考虑.
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改进的质谱兼容的胶内酶切方法
目的:改善胶内酶切的肽段回收率,提高蛋白质的有效鉴定率.方法:将改进的胶内酶切"四步提取法",应用到96个双向电泳蛋白质斑点分析.结果:该方法提高了胶内蛋白质酶切肽段的回收率,改善了质谱图谱的质量.蛋白质的有效鉴定率达89.6%,其中,数据库检索得分80分以上者达82%.另外,证实了酶解原液直接用于质谱分析可获得较好信噪比的谱图.结论:应用"四步提取法"使得酶解肽段提取率和蛋白质的有效鉴定率明显提高.
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Hela细胞蛋白质分离和肽质量指纹谱鉴定方法的建立
目的 研究Hela细胞总蛋白质的分离及利用肽质量指纹谱对蛋白质进行鉴定的方法 .方法 提取了Hela细胞的总蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行了分离,并应用图像扫描仪及图像分析软件获取蛋白质点的数字化信息.对其中不同丰度的蛋白质点,进行胶内酶切后,通过基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱(MALDI O-TOF-MS)分析,再将检测出的多肽质量数通过Mascot搜索引擎检索NCBInr数据库.结果 获得了Hela细胞总蛋白质双向电泳图谱及蛋白质点的数字化信息,通过MALDI O-TOF-MS检测得到的肽质量指纹谱再经过网上公共数据的检索从而获得3个蛋白质点分别是α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、γ-肌动蛋白(γ-actin)和过氧化物酶2(peroxiredoxin 2).结论 Hela细胞总蛋白质双向电泳的分离效果较好,肽质量指纹谱法能有效地对Hela细胞的蛋白质斑点进行鉴定.
关键词： Hela细胞 蛋白质组 2-DE MALDIO-TOF-MS 肽质量指纹图谱 -
肽质量指纹图谱鉴别诊断ⅠgA肾病和非ⅠgA肾病的可行性分析
目的 探索肽质量指纹图谱(PMF)在IgA肾病和非IgA肾病的分类中是否可行.方法 采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)分析IgA肾病和非IgA肾病患者的血清肽质量指纹图谱.结果 IgA肾病和非IgA肾病的血清肽质量指纹图谱具有9个差异多肽；其中,显著的两个多肽峰是4476.46和1968.10,ROC曲线下面积分别为86.18％和179.77％;主因素分析(PCA)表明前8个因素（差异峰）的累积解释变异量超过95％,说明该模型的鉴别诊断能力较好.比对蛋白质数据库,多肽5338.08为粘蛋白4同工型的片段；而多肽2082.77为α1-Ⅱ型胶原同工型的片段.结论 MALDI-TOF质谱技术在IgA肾病和非IgA肾病的分类中,具有可行性,此技术在系统疾病的亚类分类中具有广阔的前景.
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适于人表皮组织蛋白质组分析的双向电泳技术
[目的]建立适于人表皮组织的双向电泳技术,并应用质谱技术对人表皮组织蛋白质组进行初步分析.[方法]利用组织匀浆法制备人表皮组织总蛋白、固相pH梯度胶条进行双向电泳、PDQuest 7.4软件比较和分析电泳图谱,利用质谱技术鉴定部分蛋白斑点.[结果]成功建立了适用于人表皮组织蛋白质组分析的双向电泳技术,获得和比较了人表皮组织双向电泳四种染色图谱.人表皮组织的蛋白质在pH5～8范围内分布均匀,分子量集中在15～100 ku之间.银染图谱获得的蛋白斑点数为586±14;对质谱兼容的几种染色方法进行比较分析,结果表明Neuhoff胶体考染更适合于人表皮组织蛋白质的双向电泳分析,其在上样量为350 μg时蛋白斑点数达394±9.匹配率为85.53%.利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术成功获得了Neuhoff胶体考染的两个蛋白斑点的肽质量指纹图谱,并鉴定为Caspase 14前体和27 ku热激蛋白1.[结论]建立的表皮组织双向电泳技术及其图谱可为皮肤蛋白质组学研究提供参考.为人皮肤蛋白质组学平台的构建奠定良好基础.
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口腔鳞癌组织与口腔正常黏膜组织蛋白质差异表达的初步研究
目的:筛选口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织的差异表达蛋白质,为研究口腔鳞癌发生机制提供实验依据.方法: 收集10 例口腔鳞癌组织及正常口腔黏膜组织,进行二维电泳,选择在表达差异量较大的29 个点进行质谱和生物信息学分析,确定所分析的蛋白质类型. 结果: 口腔鳞癌及相应正常口腔黏膜组织凝胶的平均蛋白质点数分别为2 325±390和2 487±281.双向凝胶电泳图显示,口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织的差异表达蛋白质点数为29 个,这29 个点在癌组织中均为低表达,对其进行了质谱(PMF)和生物信息学分析,鉴定了其中的3 个点,它们是:β纤维蛋白(fibrin beta)、磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase TIM)、unknown蛋白.结论: β纤维蛋白、磷酸丙糖异构酶、unknown蛋白在口腔鳞癌发生发展过程中发生了改变,其机制尚待进一步阐明.
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应用双向电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓差异蛋白
目的:筛选口腔扁平苔藓及正常黏膜组织的差异表达蛋白,为口腔扁平苔藓的发病机制及诊断治疗的研究提供实验室依据.方法:收集口腔扁平苔藓组织及正常口腔黏膜组织,提取组织蛋白,蛋白定量,进行双向电泳,图象分析寻找差异点,基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析鉴定表达差异量较大的蛋白质点,确定所分析的蛋白质类型和功能.结果:(1)人口腔扁平苔藓及正常黏膜组织的双向电泳图谱的平均蛋白质点数分别为1 576±67和1 608±73,同一组织凝胶在蛋白质点位置上重复性较好.(2)通过比较人口腔扁平苔藓与正常黏膜组织的双向凝胶电泳图谱,得到差异表达蛋白质点数为13个,其中7个点在口腔扁平苔藓中为高表达,6个点在口腔扁平苔藓中为低表达.选择1O个表达差异量较大的蛋白质点进行质谱和生物信息学分析,鉴定了其中的4个点,包括有锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD),膜联蛋白I,波形蛋白,未知蛋白等.结论:锰超氧化物歧化酶,膜联蛋白I,波形蛋白,未知蛋白可能参与了口腔扁平苔藓的发生和发展,其相关机制尚待进一步阐明.双向电泳-质谱分析技术为口腔扁平苔藓发生发展过程中差异表达蛋白的研究提供了有效的技术手段.
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正常乳腺与乳腺癌核基质蛋白的双相电泳-飞行时间质谱研究
目的:应用比较蛋白质组学方法分析正常乳腺与乳腺癌组织的差异表达核基质蛋白,为人乳腺癌发病机制及其早期诊断的研究提供理论依据.方法:应用双相电泳(2-DE)每组分离4例乳腺组织核基质蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF);通过Mascot软件查询NCBI数据库鉴定蛋白质.结果:每张图谱约检测到900个蛋白质点,共发现27个差异表达蛋白,选择背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子质量及等电点,初步鉴定了12种蛋白质.结论:这些差异蛋白质部分有望成为乳腺癌诊断及治疗的分子标志物.
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小细胞肺癌及其配对的正常肺组织差异表达蛋白质的双相电泳-飞行时间质谱研究
目的 应用比较蛋白质组学方法分析小细胞肺癌(SCLC)与其配对的正常肺组织差异表达蛋白质,为阐明SCLC发病机制、筛选其早期诊断标志物提供有益的思路.方法 应用双相电泳(2-DE)分离6例SCLC及其配对的正常肺组织可溶性总蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF);通过Mascot软件查询NCBI或SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质.结果 每张图谱约检测到800多个蛋白质点.经匹配分析,肺癌组织之间和正常肺组织之间凝胶图像的匹配率分别为75.5%和78.2%;选择14个背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子量及等电点(pI),初步鉴定了u种(六类)蛋白质:①与蛋白质降解通路有关的蛋白质:蛋白酶体α亚单位3型、蛋白酶体β亚单位2型及β亚单位5型;②自由基/抗氧化剂类:锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和黄素还原酶(FR);③细胞骨架类:原肌球蛋白-3(Tpm-3);④与能量代谢有关的蛋白质:硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX1);⑤分子伴侣:抑制素(PHB),内质网蛋白ER29(Erp29);⑥其他:可溶性NSF黏附蛋白(alpha SNAP).结论 应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法分离并初步鉴定了11种(六类)蛋白质;这些蛋白质与SCLC发生发展密切相关,部分可能成为SCLC诊断及治疗的分子靶点.
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PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞系的差异表达蛋白质组分析
目的 研究PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异.方法 运用双向电泳技术比较PtenL/LMEFs与Pten△/△MEFs细胞的蛋白表达差异,6个差异蛋白进行胶内酶切后运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析,肽质量指纹图谱检索数据库后5个蛋白得到鉴定.结果 同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比,磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1, PGAM1)和肽脯氨酰顺反异构酶C(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase C, cyclophilin C)在Pten△/△MEFs细胞中表达上调而Transgelin 2蛋白在Pten△/△MEFs细胞中表达下调.经鉴定已知蛋白点B和F都是过氧化物氧化还原酶6(Peroxiredoxin-6),蛋白点B在Pten△/△MEFs细胞中表达而在Pten△/△MEFs细胞中检测不到,蛋白点B和F的分子质量相似而等电点不同,可能是由于翻译后修饰.结论 同对照PTEN野生型细胞PtenL/LMEFs相比,PTEN缺失的Pten△/△MEFs细胞有明显的差异性蛋白表达谱.PTEN的缺失引起细胞内多种蛋白表达改变,这些表达改变的蛋白可能与PTEN缺失后细胞癌变相关.
关键词： PTEN 双向电泳 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 肽质量指纹图谱 -
酶切质谱法和氰基化裂解法联合解析新药重组人门冬胰岛素二硫键
目的:建立一种简化、快速、准确的分析含有相邻Cys的双链型二硫键的方法,并确定重组人门冬胰岛素的二硫键.方法:(1) ESI-Q-TOF质谱准确测定样品还原烷基化及烷基化前后的相对分子质量,计算二硫键数和自由巯基数;(2)采集Glu-C酶切肽质量指纹谱,MS-Bridge检索并确定1对链间二硫键;(3)简化氰基化裂解法步骤,LC-MS/MS测定关键肽段序列,自编软件结合人工解析,确定第2、3对二硫键.结果:(1)相对分子质量测定出重组人门冬胰岛素含3对二硫键;(2)酶切肽谱的序列覆盖率为100％,关键肽段m/z 1377.5568、m/z 2493.1045,测量偏差小于0.05,对应二硫键A20-B19.(3) Glu-C酶切液经氰基衍生后以ZipTip除盐代替HPLC制备,氨水裂解后用MALDI-TOF测肽谱,获得关键肽段m/z1530.7163,对应二硫键A6-A11,其串联质谱共匹配14个关键序列离子,碎片离子强度高,质量偏差小于0.01,证实该二硫键连接正确.结论:新药重组人门冬胰岛素主要的二硫键连接方式为A6-A11、A7-B7、A20-B19,与已知胰岛素一致.本方法降低了双链连接型胰岛素二硫键分析复杂度,简化了步骤,具有良好的实用性.
