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杞贞胶囊对视网膜神经节细胞保护作用及其作用机制的实验研究
目的 探索杞贞胶囊对大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞的保护作用及其作用机制.设计 实验研究.研究对象 SPF级SD大鼠72只.方法 72只SD大鼠随机分为2组:用药组36只;对照组36只.两组大鼠右眼行视神经夹伤,于球后2mm处用40 g微型视神经夹夹伤视神经60 s.左眼作为正常对照.夹伤后2小时及此后每日予以灌胃给药一次.用药组给予20％杞贞溶液2.5 ml/kg,对照组给予生理盐水2.5 ml/kg.给药第28天取眼球标本,用药组和对照组各取24只行HE染色、Tunel试剂盒染色、Caspase-3免疫组化染色;剩余每组12只分离视网膜提取mRNA,测定Bax和Bcl-2基因的表达量.主要指标 视网膜厚度、Bax和Bcl-2基因表达量.结果 用药组视网膜厚度平均为(109.0±4.4) μm;对照组视网膜厚度为(101.8±7.6)μm(F29.497,P=0.028).两组间Bax基因表达差异具有统计学意义(t=1.089,P=0.028);Bcl-2基因表达差异未见统计学意义(t=0.553,P=0.692).结论 杞贞胶囊对大鼠视神经夹伤后的视网膜神经节细胞具有保护作用,可能通过下调Bax基因表达和抑制Caspase蛋白活性从而减少视网膜神经节细胞凋亡.
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胰高血糖素类肽-1缓释珠对大鼠视网膜神经节细胞的保护作用
目的 探讨玻璃体内植入胰高血糖素类肽-1(GLP-1)缓释珠对大鼠视网膜神经节细胞的保护作用.设计实验研究.研究对象SPF级sprague-Dawley(SD)雄性大鼠25只.方法 将25只大鼠随机分为2组,实验组13只,对照组12只.实验组大鼠右眼玻璃体内植入4个GLP-1缓释珠,对照组右眼玻璃体内注入4μl复方氯化钠.GLP-1缓释珠直径600 μm,内含3000个整合了GLP-1基因的人骨髓问充质干细胞,外被致密的藻酸盐外膜,以确保GLP-1产物可顺利释放而不引起免疫排斥.玻璃体内注射均在右眼视神经夹伤后立即进行.视神经夹伤后第23天用3%荧光金从双侧上丘做逆行标记,第28天取双眼球标本做视网膜铺片并在荧光显微镜下拍摄照片,采用人工双盲法进行视网膜神经节细胞计数.主要指标视网膜神经节细胞密度以及视网膜神经节细胞存活率.结果 视网膜神经节细胞密度实验组与对照组分别为(2113±474)/mm2和(1734±424),mm2,两组之间的差异有统计学意义(t=-2.111,P=0.046).视网膜神经节细胞存活率实验组与对照组分别为(74±18)%和(57±16)%,两组之间的差异有统计学意义(t=-2.451,P=0.022).结论 GLP-1缓释珠玻璃体内植入后对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞具有保护作用,可以提高视网膜神经节细胞存活率.
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饱和氢气水对大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞保护作用的实验研究
目的 探索饱和氢气水对大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用.设计 实验研究.研究对象 SPF级SD大鼠18只.方法 对18只大鼠采用随机数表法随机分为3组,每组6只.均选取右眼为实验眼,左眼为正常对照眼.使用40 g微型视神经夹在大鼠视神经球后2mm处夹持60s建立视神经夹伤模型.A组给予饱和氢气水腹腔注射,5ml/kg,每日1次;B组和C组分别给予饱和氢气水和生理盐水滴眼,每次1滴,每日3次.用药第9天,麻醉下采用3％荧光金双上丘两点注射法逆行标记大鼠RGC,第14天深麻醉下取眼球并处死动物,行视网膜定向铺片,距离视乳头中心上下左右各2 mm拍摄照片,盲法计数RGC.主要指标 RGC存活率.结果 A组、B组和C组RGC存活率分别为40.35％±13.04％、58.34％±14.00％和43.07％±7.80％(F=3.965,P=0.041).其中B组与A组和C组之间均有显著性差异(P=0.020;P=0.042);A组和C组之间无显著性差异(P=0.698).结论 饱和氢气水滴眼2周对大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞可能具有一定的保护作用.
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天麻钩藤饮抗大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞凋亡作用的实验研究
目的 观察天麻钩藤饮对视神经夹伤模型大鼠视网膜神经上皮层厚度和视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的影响.设计 实验研究.研究对象 SPF级雄性Wistar大鼠48只.方法 将大鼠随机分6组,每组8只,分别为正常对照组,阴性对照组,天麻钩藤饮低剂量组(0.6 g/ml)、中剂量组(1.2 g/ml)、高剂量组(2.4 g/ml)和银杏叶片阳性对照组(1.2 mg/ml),除正常对照组大鼠不做处理,其他组大鼠右眼均建立视神经夹伤模型,正常对照组和阴性对照组给予纯净水灌胃.于给药30天处死动物取眼球,做石蜡切片HE染色,观察各组视网膜神经上皮层厚度,TUNEL法检测RGC的凋亡程度.主要指标 HE染色视网膜神经上皮厚度及RGC凋亡数量.结果 阴性对照组(171.04±13.86 μm)比正常组(208.98±8.46 μm)视网膜神经上皮厚度显著减少(P=0.000).而天麻钩藤饮中、高剂量组大鼠视网膜厚度(分别为187.68±11.16 μm和189.22±9.54μm)比阴性对照组显著增加(P=0.043,0.001),且中、高剂量组与阳性对照组(191.35±9.03 μm)之间无显著差异(P=0.052,0.670);TUNEL凋亡检测发现,阴性对照组凋亡细胞数(9.09±2.24个/高倍视野)比正常组(0.59±0.61个/高倍视野)明显增加(P=0.000),中剂量组、高剂量组和阳性对照组RGC的凋亡(分别为7.00±1.88,5.22±2.05,5.03±2.03个/高倍视野)均比阴性对照组显著减少(P=0.024,0.000,0.000).结论 天麻钩藤饮对大鼠视神经夹伤模型具有一定抗RGC凋亡的作用,随药物浓度的升高,抗凋亡作用更显著.
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兔视神经损伤后视网膜一氧化氮的表达与神经节细胞凋亡关系的研究
目的 通过建立兔视神经夹伤模型,观察伤后视网膜组织中一氧化氮的表达与视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的关系,从而探讨RGCs凋亡机制及氨基胍(AG)在伤后对RGCs的保护性作用.方法 55只成年大耳白兔,随机分正常对照组(5只)、损伤对照组(25只)、AG治疗组(25只).损伤组双眼夹伤视神经,按伤后1、3、7、14、21 d又随机分为5组(5只/组).AG治疗组于伤后2 min耳缘静脉注射2％ AG,损伤对照组同法注射生理盐水.应用TUNEL染色计数凋亡阳性细胞;比色法测量一氧化氮(NO)含量、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力.结果 正常组视网膜切片中极少见RGCs凋亡.损伤组于伤后1d偶见,3～7d逐渐增多,至14 d达高峰,之后逐渐下降.正常视网膜组织中很少表达iNOS,但含有少量NO.在损伤后二者含量逐渐增高,与RGCs凋亡呈正相关性.同一时间点损伤对照组和AG治疗组比较差异有统计学意义.结论 兔视神经夹伤后,NO合成增多可能是引起RGCs凋亡的一个因素.而AG通过减少NO的合成,降低RGCs凋亡,对RGCs有保护性作用.
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辛伐他汀对视神经夹伤后小鼠视网膜神经节细胞的保护作用
目的 探讨辛伐他汀对视神经损伤后(optic nerve crush,ONC)视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的保护作用.方法 将60只昆明鼠分为正常组、假损伤组、损伤组和辛伐他汀修复组.正常组不作任何处理,假损伤组只暴露视神经不损伤,损伤组行左眼视神经夹伤手术后,玻璃体内注射平衡溶剂(50 mg·mE-1乙醇和1 tool·L-1 NaOH的混合溶剂,并用1 mol·L-盐酸激活并调节pH值为7.2),辛伐他汀修复组行左眼视神经夹伤手术后,玻璃体腔注射不同浓度辛伐他汀(0.5g·L-1、1.0 g·L-1、1.5 g·L-1).Brn3a免疫荧光染色、HE染色、甲苯胺蓝染色检测RGC凋亡及视神经的病理变化.结果 术后7d,损伤组RGC凋亡明显,RGC存活率降低至(35.1±3.9)％,RGC层到外核层厚度由(123.13±1.04) μm降低至(97.48±2.33) μm,与正常组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);视神经纤维束状排列消失,神经胶质细胞轴突聚集成团,肿胀变形,退行性病变严重,与正常组相比差异显著.玻璃体内注射1.0g·L-1辛伐他汀后,RGC存活率增加至(76.3±3.7)％(P＜0.05),RGC层到外核层厚度增加至(111.39±4.06) μm,与损伤组相比,差异有统计学意义(P＜0.01),视神经退行性病变明显改善,胶质细胞轴突和神经纤维束状结构趋于正常.结论 玻璃体内注射辛伐他汀可以减缓视神经退行性病变,提高RGC存活率.
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视神经夹伤合并晶状体损伤大鼠视网膜中神经元型一氧化氮合酶的表达
目的 观察视神经夹伤合并晶状体损伤大鼠视网膜中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达.方法 建立视神经夹伤合并晶状体损伤大鼠模型,Western blot检测正常组及损伤后不同时间点nNOS在术侧和对侧视网膜中的表达情况,免疫组织化学和免疫荧光染色观察nNOS在视网膜中的表达和定位.结果 Western blot结果显示,nNOS蛋白在正常视网膜中明显表达;在术侧视网膜中,从损伤后ld开始nNOS蛋白的表达下降,术后3d表达低,与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05);5 d开始上升,7d达高峰,但未达到正常表达水平,7d时的表达水平与5d比较差异有统计学意义(P＜0.05),14 d时表达又下降.对侧视网膜中,nNOS的变化趋势与术侧基本一致,但各时间点变化幅度较小.免疫组织化学和免疫荧光染色结果显示nNOS主要表达在节细胞层,在外丛状层有微弱表达,与NeuN标记的神经元共定位.结论 nNOS在视神经夹伤合并晶状体损伤大鼠视网膜组织中表达明显改变,晶状体损伤能促进视神经夹伤大鼠术侧和对侧视网膜中神经元的存活,提示晶状体损伤能同时保护同侧和对侧视网膜神经元.
关键词： 视神经夹伤 晶状体损伤 神经元型一氧化氮合酶 神经元 大鼠 -
天麻钩藤饮对视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用及其机制
目的 研究天麻钩藤饮对视神经夹伤模型大鼠RGCs的保护作用及其抗氧化作用机制. 方法 按照随机数字表法将50只SPF级雄性Wistar大鼠分为单纯模型组17只、1.2 g/ml天麻钩藤饮组16只和2.4 g/ml天麻钩藤饮组17只,均取右眼制作视神经夹伤模型,1.2 g/ml天麻钩藤饮组和2.4 g/ml天麻钩藤饮组大鼠均于造模后2h按剂量以灌胃方式给予天麻钩藤饮10 ml/kg,共连续给药28 d,单纯模型组大鼠以同样方法用等量蒸馏水灌胃.于造模后第23天,应用随机数字表法随机选取单纯模型组8只、1.2 g/ml天麻钩藤饮组7只和2.4 g/ml天麻钩藤饮组8只大鼠用微量注射器将质量分数3％荧光金(FG)注射到双侧上丘各3μl行RGCs逆行标记,于造模后第28天处死大鼠,然后采集眼球标本制作视网膜铺片并计数RGCs.各组剩余9只大鼠采用化学比色法测定视网膜谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性.结果 单纯模型组及1.2 g/ml和2.4 g/ml天麻钩藤饮组大鼠RGCs存活率分别为(59.67±9.85)％、(71.33±9.14)％和(73.63±8.33)％,组间总体比较差异有统计学意义(F=5.322,P=0.014),其中1.2 g/ml天麻钩藤饮组和2.4 g/ml天麻钩藤饮组大鼠RGCs存活率均明显高于单纯模型组,差异均有统计学意义(P=0.023、0.006).单纯模型组及1.2 g/ml天麻钩藤饮组和2.4 g/ml天麻钩藤饮组大鼠视网膜GSH-Px比活性分别为(222.20±76.67)、(311.30±46.93)和(473.65±117.73) μmol/(s·mg),组间总体比较差异有统计学意义(F=20.005,P＜0.001),其中2.4 g/ml天麻钩藤饮组GSH-Px比活性均明显高于单纯模型组和1.2 g/ml天麻钩藤饮组,差异均有统计学意义(P＜0.001;P=0.001).结论 天麻钩藤饮能有效保护视神经损伤后的RGCs,提高RGCs的存活率.视神经损伤后口服2.4 g/ml天麻钩藤饮可提高大鼠视网膜中GSH-Px活性,提示抗氧化可能是天麻钩藤饮发挥视神经细胞保护作用的机制之一.
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醛糖还原酶基因敲除促进视神经损伤后巨噬细胞向M2方向极化并促进视神经功能恢复
目的 观察小鼠视神经夹伤(ONC)后醛糖还原酶(AR)对视神经损伤后功能恢复的影响及可能机制.方法 分别采用C57BL/6-AR“+(B6野生型)、C57BL/6-AR-/-(AR基因敲除)、hy1-YFP/AR+/+和Thy1-YFP/AR-/-小鼠,建立ONC模型.行视觉电生理F-VEP检查,观察ONC后AR基因敲除对小鼠视神经转导功能的影响;通过视网膜组织冰冻切片,观察AR基因敲除对Thy1-YFP转基因小鼠ONC后存活视网膜神经节细胞数目的影响;玻璃体内注射Alexa Fluor(R) 488标记的霍乱毒素B(CTB)顺行标记,观察AR基因敲除对小鼠ONC后神经纤维生长的影响;Western blot法检测野生型小鼠ONC后AR基因的表达变化,及AR基因敲除对M1、M2型巨噬细胞特异性分子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)表达的影响.结果 AR基因敲除可促进小鼠ONC后视神经转导功能的恢复,增加存活的视神经节细胞数量;AR基因敲除可促进小鼠ONC后视神经纤维生长;AR基因敲除可促使小鼠ONC后巨噬细胞向M2方向极化.结论 AR可能通过调节视神经损伤后巨噬细胞极化影响视神经功能恢复.
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血源性巨噬细胞在小鼠视神经损伤中的作用
目的:探讨血源性巨噬细胞在小鼠视神经损伤中的作用.方法:首先用UBC-GFP小鼠(供体)和野生型小鼠(受体)制备骨髓嵌合体动物区分血源性巨噬细胞和小胶质细胞来源的巨噬细胞,免疫荧光组织化学染色观察视神经夹伤后血源性巨噬细胞在损伤区浸润及活化情况.其次利用CCR2 KO小鼠,上丘定位注射荧光金逆行标记视网膜节细胞(RGC),观察损伤区缺乏血液来源的巨噬细胞浸润时相应神经元胞体RGC的存活情况.结果:骨髓嵌合体小鼠显示视神经损伤区有大量的血源性巨噬细胞(Iba-1+ GFP+)浸润、且此类细胞内多表达M2型巨噬细胞标记精氨酸酶1(arginase 1);CCR2 KO小鼠视神经夹伤后7d同侧视网膜上存活RGC的数目明显少于野生型小鼠(P＜0.01),其损伤区活化巨噬细胞(CD68+)的数目同野生型小鼠相比无明显差异(P＞0.05),但CCR2KO小鼠损伤区arginase 1的表达较野生型小鼠明显有所降低(P ＜0.001).结论:视神经损伤后损伤区血液来源巨噬细胞不同于小胶质细胞,血液来源的巨噬细胞多向M2方向极化,表达arginase 1,对RGC存活具有保护作用.
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成年大鼠视神经夹伤后TLR4与GAP-43表达时程的比较
目的:明确视神经损伤引起的固有免疫应答反应与视网膜神经节细胞轴突再生之间的时间关系.方法:将成年SD大鼠随机分为视神经损伤组与假手术对照组,损伤组动物左侧视神经以钳夹法损伤,对照组仅暴露左侧视神经.手术第1、3、7d处死后取左侧视神经干,用Western Blot方法检测视神经干toll样受体4(toll-likereceptor4,TLR4)和生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43,GAP-43)蛋白表达水平.结果:视神经干内TLR4和GAP-43蛋白在损伤后第1d都趋于表达上调,但其后的变化趋势具有不同的时间特征,即TLR4持续上调,并在损伤后7～14 d内维持呈平台;而GAP-43的表达在损伤后第7d呈峰值,其后逐渐下降,第14 d基本恢复至基线水平.结论:TLR4介导的固有免疫应答有可能影响视神经再生;TLR4和GAP-43表达变化的不同为进一步研究固有免疫应答对视神经再生的影响提供了有益的线索.
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中药复光颗粒对家兔视神经夹伤后Bcl-2和Bax表达的影响
目的:观察复光颗粒对家兔受损视神经的保护作用.方法:采用视神经夹伤方法,建立家兔外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy,TON)模型,通过测定凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,观察复光颗粒对受损视神经的影响.结果:视神经夹伤后,凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达及Bcl-2/Bax值在复光颗粒组间(低、高剂量组)比较无显著差异性(P>0.05).而复光颗粒各组与模型对照组间均有显著差异(P<0.05),复光颗粒各组较模型组Bcl-2表达增加,Bax表达减少.结论:在本实验条件下,复光颗粒具有上调抗凋亡基因Bcl-2和下调促凋亡基因Bax表达的作用,可减轻视神经损伤的作用.
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银杏叶提取物对兔视神经夹伤后视网膜视神经节细胞的保护作用
目的:研究EGb761对视神经夹伤后兔视网膜视神经节细胞(RGC)的保护作用.方法:大白兔24只,右眼为实验组,左眼为对照组,制作视神经夹伤模型.右眼球后注射EGb761(60mg/kg),左眼球后注射等容量平衡盐液BSS.于伤后4,7,14d取材,应用病理图像分析仪计数RGC;并进行髓鞘碱性蛋白(MBP)的免疫组化染色分析.结果:伤后3～14d,两组RGC 数目均下降,差异有统计学意义(P<0.01);实验组RGC数目明显高于盐水组,差异有统计学意义(P<0.01);伤后两组均有MBP阳性表达,BSS组表现为强阳性;实验组MBP表达呈下降趋势,14d表达呈弱阳性;BSS组表达也随时间有所减弱,但14d时表达仍明显;不同时间点实验组RGC阳性率均低于BSS组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论:EGb761能降低视神经夹伤后MBP的含量,提高RGC的存活数量.
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天麻钩藤饮抗大鼠视网膜神经节细胞凋亡机制的实验研究
目的:从蛋白分子水平分析天麻钩藤饮抗大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞凋亡的机制.方法:将所有大鼠36只随机分为天麻钩藤饮低剂量组(0.6g/mL,n=6)、中剂量组(1.2g/mL,n=6)、高剂量组(2.4g/mL,n=6)、正常对照组(n=6)、阴性对照组(n=6)和银杏叶片阳性对照组(1.2mg/mL,n=6)共6组,再将30只SPF级雄性Wistar大鼠(除正常对照组外其余五组)制备成视神经夹伤模型.检测N-甲基-D-天冬氨酸2B(N-methyl-D-aspartic acid receptor 2B,NMDA2B)受体蛋白平均灰度值和β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)平均灰度值.结果:天麻钩藤饮低、中、高剂量组NMDA2B受体蛋白平均灰度值较阴性对照组明显减少(P＜0.001),并与阳性对照组比较差异无统计学意义(P=0.320),正常对照组与阴性对照组具有显著性差异(P＜0.001).天麻钩藤饮中、高剂量组β-淀粉样蛋白平均灰度值较阴性对照组明显减少(P=0.086、0.001);低浓度组较阴性对照组减少,但差异无统计学意义(P=0.614);其中高剂量组和阳性对照组之间比较,差异无统计学意义(P=0.376);正常对照组与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.001).结论:天麻钩藤饮可以通过下调NMDA2B受体蛋白的表达和控制β-淀粉样蛋白的沉积来减少视网膜神经节细胞的损伤和凋亡,并以此机制对视网膜神经节细胞起到一定的保护作用.
关键词： 天麻钩藤饮 视神经夹伤 视网膜神经节细胞 NMDA2B受体蛋白 β-淀粉样蛋白 -
PEDF对视神经夹伤模型大鼠视网膜组织中NO和Caspase-3表达的影响
目的:分析色素上皮衍生因子(pigment epithelium-deriverd factor,PEDF)对视神经夹伤模型大鼠视网膜组织一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cysteine-containing aspartate-specific proteases-3,Caspase-3)表达的影响.方法:选择60只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、PEDF组各20只,除空白对照组外,均建立视神经夹伤大鼠模型,均取左侧眼球为标本,造模成功后,模型组玻璃体腔内注射平衡盐溶液5μL,PEDF组玻璃体内注射5μL PEDF(浓度0.2μg/μL).2wk后取视网膜组织,行HE染色后光镜下观察视网膜形态的变化,采用比色法测定NO含量的变化,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法、蛋白印迹法(Western-blot)检测Caspase-3 mRNA和蛋白表达情况.结果:HE染色发现,空白对照组视网膜组织排列整齐且清晰,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)呈单层细胞排列,细胞为卵圆形,大小均匀,分布均匀,细胞核清晰,排列紧密,边界清晰;模型组视网膜组织结构稀疏,RGCs呈空泡样变化,整体细胞数量减少,残留RGCs细胞核见固缩,染色不均.PEDF组视网膜组织残留神经节细胞轻微水肿,但RGCs细胞层排列尚且紧密,且受损程度明显轻于模型组;模型组、PEDF组Caspase-3 mRNA和蛋白水平高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);PDEF组Caspase-3 mRNA和蛋白水平低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05).模型组、PEDF组NO含量高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);PEDF组NO含量低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05).结论:采用PEDF干预可下调视神经损伤大鼠Caspase-3、NO的表达,减轻RGCs细胞损伤.
