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重组人乳铁蛋白诱导人口腔癌Tca8113细胞自噬及凋亡
目的 研究重组人乳铁蛋白(rhLF)对人口腔癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响.方法 MTT法检测不同浓度的rhLF作用细胞不同时间对其增殖的影响,并分别用不同浓度的rhLF处理细胞后观察其对集落克隆形成的影响;不同浓度的rhLF处理细胞后线粒体膜电位的变化.采用免疫荧光技术检测rhLF处理前后自噬体的形成情况.免疫蛋白印迹法(Western blot)检测不同浓度rhLF处理细胞后细胞自噬相关蛋白P62和LC3表达变化,AnnexinⅤ-PI双染色检测rhLF对细胞凋亡的影响;Western blot检测不同浓度的rhLF处理细胞后聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达变化.所有数据采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析.结果 rhLF对口腔癌Tca8113细胞的增殖及存活有明显的增殖抑制作用,并呈药物浓度和时间依赖性,且各药物处理组与对照组相比有统计学意义(P<0.05).rhLF抑制口腔癌Tca8113细胞克隆形成;JC-1荧光检测显示口腔癌Tca8113细胞经rhLF处理后其线粒体膜电位下降;rhLF处理后形成自噬体,不同浓度rhLF处理细胞后细胞自噬相关蛋白P62表达下降及LC3-Ⅱ表达增加,0、100、200μg/ml的rhLF处理口腔癌Tca8113细胞48 h的凋亡率为3.9%、8.2%、42.6%,组间差异有统计学意义(P<0.05).Western blot结果显示,rhLF处理口腔癌Tca8113细胞后PARP、Caspase-3被激活.结论 rhLF能显著抑制Tca8113细胞的增殖并诱导其细胞凋亡,其机制与线粒体凋亡途径的激活应激有关.
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抗Erbin特异性单克隆抗体的制备及鉴定
目的:制备抗Erbin单克隆抗体.方法:应用基因工程技术构建含Erbin PDZ序列的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)以获得重组蛋白的表达;采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白;通过质谱鉴定重组蛋白;利用纯化的重组蛋白免疫小鼠,通过细胞融合技术制备单克隆抗体.结果:构建了原核表达载体pET-28a(+)-Erbin PDZ,获得了重组蛋白在工程菌中的高效表达.通过对以包涵体形式存在的重组蛋白进行洗涤、溶解、复性和纯化,获得了纯度在90%以上的重组蛋白.经质谱鉴定确证表达的重组蛋白为Erbin PDZ.用重组蛋白免疫小鼠后,经细胞融合、筛选及鉴定,获得了高效价的单克隆抗体.讨论:该抗体可识别天然状态下的Erbin蛋白,可用于ELISA、免疫荧光和免疫沉淀实验.抗Erbin单克隆抗体的制备为研究Erbin的功能奠定了基础.
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细胞间粘附分子重组蛋白的表达与单克隆抗体的制备
细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)是属于免疫球蛋白超家族的一类粘附分子,其配体是β2整合素的两个成员:LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18).ICAM-1与其配体的结合具有重要的免疫学功能:首先它介导了T细胞和NK细胞对靶细胞的杀伤作用;其次它还是T细胞激活的共刺激信号之一,在白细胞与血管内皮细胞的粘附中起重要作用;另外ICAM-1是鼻病毒的受体,还参与肿瘤细胞的转移.ICAM-1已成为抗炎症治疗的重要靶标.本文报道了重组ICAM-1的表达及单克隆抗体的制备及鉴定.
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重组人凝血因子Ⅶ的研究进展
人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ,hFⅦ)是参与血液凝血级联反应的蛋白之一,在凝血过程中发挥极其重要的作用.hFⅦ主要用于治疗和预防先天性或获得性血友病患者的出血,还可用于非血友病患者的创伤性大出血.通过基因工程技术制备hFⅦ不仅安全,而且还易于大规模生产.已有文献报道在利什曼原虫、昆虫细胞、多种哺乳动物细胞以及转基因兔乳腺中成功表达重组hFⅦ.因此,开发能高效表达重组hFⅦ的表达系统,将使大规模生产hFⅦ成为可能.
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重组4-1BB配体对治疗性重组人乳头瘤病毒16型蛋白疫苗的佐剂作用
目的 研究重组4-1BB配体(recombinant 4-1BB ligand,r4-1BBL)作为佐剂对治疗性重组人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus-16,HPV16)蛋白疫苗(HPV16蛋白疫苗)免疫效果的影响.方法 对4-1BBL胞外功能区进行密码子优化,并通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点定向插入pET28a表达载体.将获得的重组表达载体转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达.用蛋白质印迹法对重组蛋白进行鉴定,并用非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电子显微镜分析重组蛋白结构.用CCK-8试剂盒检测纯化r4-1BBL对小鼠T细胞体外增殖的影响.同时将r4-1BBL与HPV16蛋白疫苗联合免疫C57BL/6小鼠,用酶联免疫斑点试验检测小鼠的细胞免疫应答水平,观察r4-1BBL对HPV16蛋白疫苗抑制肿瘤生长的影响.结果 密码子优化的4-1BBL胞外功能区能在重组表达载体中表达,且表达产物同时以包涵体和可溶性形式存在.可溶性产物的结构主要为二聚体,电子显微镜下可以观察到类似亚单位的结构.纯化r4-1BBL可促进小鼠脾淋巴细胞的体外增殖.与单纯HPV16蛋白疫苗相比,r4-1BBL联合HPV16蛋白疫苗能诱导更强的特异性细胞免疫应答(t=3.525,P=0.024)和产生更明显的肿瘤生长抑制作用(t=2.534,P=0.021).结论 r4-1BBL能在小鼠中提高HPV16蛋白疫苗的免疫效果,具有作为HPV16蛋白疫苗佐剂的潜力.
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重组人可溶性DR5 蛋白的表达、制备及其生物活性检测
目的:纯化毕赤酵母GS115菌株表达的重组人可溶性死亡受体5(DR5)蛋白,并研究其对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)所诱导细胞凋亡的阻断效应.方法:大量扩增可溶性DR5酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株,收集上清,利用ProBondTM亲和层析柱纯化获得重组可溶性DR5蛋白,用SDS-PAGE、Western Blot检验纯化产物的特异性和纯度.用MTT法检测纯化的可溶性DR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡作用的阻断效应.结果:转化阳性的毕赤酵母GS115菌株可成功表达分子量为26 kD的可溶性DR5蛋白,经ProBondTM亲和层析柱纯化,SDS-PAGE、Western Blot鉴定,结果显示获得了高纯度的重组人可溶性DR5蛋白,蛋白产量达20μg/ml;体外活性检测结果显示,纯化的可溶性DR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的Hela细胞的凋亡,阻断率高达53.6%.结论:经纯化后的重组人可溶性DR5蛋白可有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应.
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SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究
目的:获得纯的重组SARSCoV M蛋白,并初步测定重组蛋白的抗原性.方法:软件分析SARSCoV M蛋白富含免疫表位的片断,体外合成编码SARSCoV M蛋白15-170aa序列的DNA片段,利用DNA重组技术,将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建重组质粒pGEX-SARSCoV M.在大肠杆菌BL21中诱导表达GST-SARSCoV M重组融合蛋白,分离纯化GST-SARSCoV M蛋白,利用纯化蛋白作为抗原,建立ELISA试验检测抗SARSCoV M抗体.结果:GST-SARSCoV M蛋白分子量为43kD,纯化的GST-SARSCoV M蛋白作为抗原检测血清中SARSCoV M抗体,53例正常成人献血者血清未检出SARSCoV M抗体.结论:SARSCoV M蛋白表达成功,在健康人血清中未检出SARSCoV M抗体.
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重组日本血吸虫SjGST-Sj32蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究
应用基因工程技术分别表达出SjGST-Sj32,Sj32和SjGST,用于保护性免疫的动物实验及其体液免疫机制的初步探讨.结果:与对照组相比,重组SjGST-Sj32组,Sj32组,Sj32+SjGST组均有明显的减虫效果(P<0.05).上述三组及SjGST组的肝脏虫卵计数均较对照组为少(P<0.01).提示重组Sj32kD蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护性免疫及抗生殖免疫效果,而SjGST仅表现出一定的抗生殖免疫效果.
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Tyrphostin AG555对重组人肌醇磷脂3-激酶p110β催化亚基活性的影响
目的:研究tyrphostin AG555对重组人肌醇磷脂3-激酶(PI3-K)p110β催化亚基的影响.方法:利用基因工程的方法获得PI3-K p110β催化亚基; 用磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸, [γ-32P]ATP与重组 PI3-K p110β催化亚基一起保温的方法测定PI3-K的活性; 用氯仿和甲醇抽提32P标记的磷脂,并以硅胶板薄层层析和放射自显影来进行分析.结果:AG555 (2.5～20 μmol/L)对重组人 PI3-K p110β催化亚基有抑制作用.结论:tyrphostin AG555是一种重组人PI3-Kp110β抑制剂.重组人PI3-K p110β催化亚基可作为一种较为简便的筛选有效的PI3-K抑制剂的反应物.
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乳胶过敏原Hev b 3的克隆表达和纯化及其过敏原性检测
目的:克隆乳胶主要过敏原Hev b 3基因,构建其原核表达载体并表达和纯化重组蛋白,了解重组的Hev b 3是否具有和相应IgE特异结合的过敏原特性.方法:用RT-PCR方法从新鲜海南橡胶树叶提取的总RNA中扩增出Hev b 3的cDNA,将其克隆于原核表达载体pQE30质粒,转化大肠杆菌XL1-Blue,酶切和测序验证构建的载体,利用Ni-NTA柱层析纯化重组蛋白并用SDS-PAGE和Western Blot验证.结果:酶切和测序结果证实克隆了正确的Hev b 3序列,重组表达并纯化的蛋白具有和特异IgE抗体结合的过敏原特性.结论:成功构建了乳胶主要过敏原的原核表达载体,并纯化了具有过敏原特性的重组蛋白,为过敏原的标准化创造了条件.
关键词： 胶乳 过敏原Hev b 3 基因表达 重组蛋白类
