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骨形成蛋白家族成员2、7对小鼠胚胎肝干细胞分化的体外研究
目的 探讨骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)对小鼠胚胎肝干细胞(HP14.5)定向诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法 将表达BMP2、BMP7、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒作为4个组分别感染HP14.5,诱导其分化,在病毒感染后的第1、4、7天通过检测荧光素酶报告基因读数,在第7天通过细胞免疫荧光染色,观察肝细胞标志物白蛋白(ALB)的表达情况；并在第4、7、10天通过PAS染色、尿素氮合成功能检测,观察诱导后HP14.5向肝细胞方向的分化成熟度.结果 BMP2组、HGF组荧光素酶读数较GFP对照组明显上升；免疫荧光染色显示,诱导7d后BMP2组、HGF组细胞质内表达肝细胞特有的ALB,而GFP对照组几乎无表达；糖原染色可见BMP2组、HGF组胞质存在紫红色颗粒,呈阳性反应；尿素合成功能检测显示BMP2组、HGF组培养液中尿素氮随时间而升高.BMP7组诱导后,细胞免疫荧光染色、荧光素酶活性、PAS染色和尿素合成检测均呈阴性或弱阳性反应.结论 BMP2具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞分化的作用,并初步具备肝细胞的合成分泌功能,而BMP7对其无诱导作用.
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同基因与异基因胚胎肝干细胞移植治疗小鼠肝硬化
背景：胚胎肝干细胞移植免疫相关研究较少，同基因与异基因胚胎肝干细胞移植对小鼠肝硬化的治疗作用，目前尚不清楚。
目的：观察同种同基因与同种异基因胚胎肝干细胞移植对小鼠肝硬化的治疗作用，以及治疗过程中免疫排斥反应发生情况。
方法：采用Ⅳ型胶原酶消化法分离纯化BALB/c与C57BL/6胚胎肝干细胞。104只健康BALB/c小鼠随机分为4组：正常对照组不予任何处理；肝硬化组、同种同基因移植组、同种异基因移植组腹腔注射四氯化碳石蜡油溶液复制肝硬化模型，16周后分别经其尾静脉注射生理盐水，等量同种同基因胚胎肝干细胞和同种异基因胚胎肝干细胞。在移植4周后比较各组受体小鼠存活情况、肝功能恢复情况、肝纤维化程度、免疫细胞(CD4+T、CD8+T、NK、NKT)数目及比值、肝脏病理学变化。
结果与结论：同种同基因移植组和同种异基因移植组生存率均为100%，与肝硬化组小鼠存活率67%相比差异有显著性意义(P <0.05)；各组肝功能和肝纤维化指标差异无显著性意义(P >0.05)。各组免疫学指标比较差异无显著性意义(P>0.05)。肝脏组织病理学显示肝组织修复：同种异基因移植组>同种同基因移植组>肝硬化组。因此，经尾静脉移植胚胎肝干细胞能提高肝硬化小鼠的生存率、减轻肝细胞坏死程度；同种同基因与同种异基因胚胎肝干细胞移植未发现免疫排斥，对小鼠肝硬化有一定的治疗作用。 -
肝干细胞研究进展
肝干细胞是具有自我更新能力和分化为成熟肝细胞与胆管上皮细胞的双向分化潜能的原始细胞.肝干细胞不仅参与了肝脏的稳态维持、损伤修复和肝再生,而且在肝脏疾病的细胞治疗、人工生物肝及肝导向基因治疗中有着巨大的应用潜能.本文对几种主要类型的肝干细胞及它们的来源、分子标志物等进行了综述.
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分泌性卷曲相关蛋白3影响小鼠胚胎肝干细胞体外成熟分化的实验研究
目的 检测不同发育阶段的肝组织中Wnt信号拮抗因子分泌性卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein,SFRP)的表达,并探讨SFRP3对胚胎肝干细胞体外成熟分化的影响.方法 分离胚胎12.5 d至出生后4周共9个阶段的小鼠肝组织,RT-PCR检测5种SFRPs在肝组织及胚胎肝干细胞14.5(embryonic liver stem cells,ELSC)中的表达水平.腺病毒SFRP3感染小鼠胚胎肝干细胞,地塞米松(dexamethasone,Dex)联合肝细胞生长因子(hepatic growth factor,HGF)诱导肝细胞分化,诱导后第3、6、9、12天检测白蛋白启动子荧光素酶报告基因(ablumin promoter-Gaussia Luciferase,ALB-Gluc)活性,诱导后第12天,RT-PCR和Western blot检测肝脏相关基因表达,PAS染色检测糖原合成功能.结果 SFRP1、4、5在不同阶段肝组织中的表达无明显差异,SFRP2和SFRP3只在胚胎期肝组织中表达,随后很快消失.ELSC14.5细胞中,SFRP2高表达而SFRP3表达很低.Dex联合HGF可有效诱导ELSC14.5细胞的体外成熟分化,与对照组相比,SFRP3过表达可降低成熟肝细胞标志白蛋白(albumin,ALB)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase,TAT)、载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A(UDP-glucuronosyl transferase,UGT1A)的水平,增强肝干细胞标志Delta蛋白(Delta-like protein,DLK)和甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)的表达,并抑制糖原合成功能.结论 SPRF3在肝脏发育过程中表达水平迅速降低,并显著抑制胚胎来源的肝干细胞体外成熟分化,其下调可能是肝脏发育和肝细胞成熟分化的一个重要因素.
关键词： 胚胎肝干细胞 分化抑制 分泌性卷曲相关蛋白3 Wnt信号拮抗因子 -
具有双向分化潜能的鼠胎肝干细胞的分离、培养及鉴定
目的：优化体外分离、培养和筛选胎鼠肝脏干细胞（LSC）的方法，并鉴定其双向分化的潜能。方法通过密度梯度离心和细胞差异性贴壁法分离小鼠胎肝干细胞（FLSC），以细胞平板克隆技术和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定FLSC的增殖，通过添加二甲基亚砜（DMSO）和 HGF等诱导干细胞分化。结果分离后的FLSC 24 h内贴壁，卵圆形，排列紧密，1～2周内活化， CD133、CD49f、EPCAM的阳性率分别为（97．95±1．21）％、（92．71±3．49）％、和（50．73±3．45）％，表达甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK19）；诱导分化后糖原染色（PAS）法染色可见红色糖原颗粒，表达清蛋白（ALB）、肝细胞核因子4α（HNF‐4α）。结论联合密度梯度离心和差异性贴壁法成功分离FLSC ，分离后的FLSC干性强，增殖能力强，具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。
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Wnt3a过表达对小鼠胚胎肝干细胞凋亡的抑制作用
目的 研究Wnt3a对ELSC14.5小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响.方法 采用表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体系统(Ad-GFP-Wnt3a)转入小鼠ELSC14.5细胞,以Ad-GFP组为空白对照组,Ad-wnt3a组为实验组.实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测Wnt3a及凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Mcl-1的mRNA和蛋白的表达；Hoechst33258染色法结合annexin-PE/7-ADD法检测细胞的凋亡情况.结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3a在ELSC14.5细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3a能高效感染ELSC14.5细胞.与对照组相比,抗凋亡因子Bcl-2、mcl-1的mRNA和蛋白的表达显著升高(P＜0.05),而促凋亡因子Bax的mRNA和蛋白的表达显著降低(P＜0.05).Hoechst33258染色结合annexin-PE/7-ADD法结果显示,Wnt3a高表达的ELSC14.5细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的细胞数量很少,细胞凋亡率降低.结论 Wnt3a通过上调Bcl-2家族中抗凋亡因子和下调促凋亡因子来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,延长其生存.
