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作用于铜绿假单胞菌外排泵的药物筛选模型的建立及初步应用
铜绿假单胞菌是耐药性十分突出的一类院内感染条件致病革兰氏阴性细菌,根据外排泵是铜绿假单胞菌产生耐药性的主要原因这一原理,以铜绿假单胞菌的外排泵为靶点,用过量表达外排泵的铜绿假单胞菌Y5和外膜微孔蛋白(OprD2)缺陷菌株7208以及铜绿假单胞菌标准菌株PAO1建立了一个作用于铜绿假单胞菌外排泵的药物筛选模型.应用此模型可以初筛作用于铜绿假单胞菌外排泵的药物以及与现有已知的抗生素有协同作用的活性物质的筛选.应用所建立的方法从2449株微生物发酵液中(真菌1 700株,放线菌700株,海洋细菌49株)筛选得到4株阳性菌,多次发酵表明这4株阳性菌产生抗铜绿假单胞菌的活性物质的性质比较稳定,进一步的工作正在进行之中.
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以组织蛋白酶K为靶点的新药筛选
组织蛋白酶K(cathepsin K)是半胱氨酸蛋白酶家族的成员,它和组织蛋白酶S、L和B有很高的同源性.人类破骨细胞中大量选择性表达组织蛋白酶K,并已证明组织蛋白酶K是参与骨胶原降解的主要酶,在骨代谢中起很大的作用,为此,组织蛋白酶K已成为治疗骨质疏松症的重要分子靶标.近年来对组织蛋白酶K的结构与功能的研究,以及以该酶为靶点的抗骨质疏松新药筛选研究已成为新药研究领域的一个热点.本文就组织蛋白酶K在骨代谢中的作用以及组织蛋白酶K抑制剂筛选模型的研究进展进行综述.
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以糖类利用能力变化选育红霉素高产菌株
目的 根据代谢网络理论,利用可能对红霉素产生菌Saccharopolyspora erythraea的代谢物流产生影响的糖类建立理性化的筛选模型.方法 建立葡萄糖、果糖、乳糖等抑制性筛选模型和麦芽糖、木糖等利用性筛选模型.将诱变处理后的菌株通过这些模型,找出利用率发生改变的菌株.结果 结果显示葡萄糖、麦芽糖模型的筛选效果较好,用此方法筛选出的菌株Er071610-1比原始出发菌株增产53.7%.结论 以糖类利用能力变化选育红霉素高产菌株是一条可行的筛选方法.
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以“广谱耐药”的摩氏摩根菌为模式菌株的筛选模型的建立及应用
目的 通过以“超广谱”、高水平耐药的摩氏摩根菌(Morganella morganii)KL-225为模式生物建立筛选模型.方法 分别在培养基中加入青霉素、头孢吡肟、链霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、交沙霉素、杆菌肽、黏菌素、利福平、磺胺嘧啶等,以此作为耐药菌的耐药筛选指标,从养殖池塘水体和病死的鲍鱼体的菌群中筛选能够耐受上述药物的新型摩氏摩根菌.结果 筛选到广谱耐药摩氏摩根菌,构建细胞水平的新型抗菌药物筛选模型,对本所重点实验室化合物库进行初筛及复筛得到阳性化合物H1,其对广谱耐药摩氏摩根菌KL-225和摩氏摩根标准菌的MIC值都是1.59μg/mL,检测了H1的抗菌谱尤其是阴性耐药抗菌谱,考察了H1的细胞毒作用.结论 通过以“广谱耐药”的摩氏摩根菌为模式菌株建立的筛选模型可用于抗耐药菌药物的发现.
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基于秀丽隐杆线虫耐药菌感染模型筛选活性化合物
目的 建立秀丽隐杆线虫—甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌感染模型,筛选抗耐药菌感染的活性化合物.方法 利用耐药菌对线虫进行感染,建立液体条件感染和抗生素救治模型,通过观察感染线虫的存活情况,考察筛选样品活性.结果 对456个样品进行考察,发现化合物sipi8294在浓度为16 μg/mL时,可以使感染线虫存活率达到60％左右.通过联合用药实验发现,8μg/mL sipi8294和8μg/mL氨苄西林联用,可以使线虫存活率提高到80％以上(vs.8μg/mL氨苄西林组,P＜0.01).sipi8294与青霉素类药物联用,具有明显的增效作用.结论 该模型能反映病原菌在线虫体内的耐药性,并可以用于化合物的筛选,发现具有抗感染或是辅助抗感染作用的化合物.
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结核分枝杆菌1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂高通量筛选模型的建立与应用
目的 建立1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂的高通量筛选模型,从不同来源的样品中筛选该酶抑制剂,以期获得作用于该靶点的全新作用机制的抗结核药物先导物.方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,克隆基因dxr构建重组表达质粒pET28a(+)::dxr; IPTG诱导表达并经Ni2+亲和层析柱纯化得到具有天然酶活性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶;基于该酶促反应底物NADPH在340nm波长下具有光吸收的原理,建立和优化酶活测定体系,构建并评价酶抑制剂的高通量筛选模型;应用此模型进行酶抑制剂筛选并进行抑酶活性及抗菌活性评价.结果 成功得到具有天然酶活性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶,构建了1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂的高通量筛选模型并得到3个抑酶活性较高的阳性化合物,其中化合物IMB-DXR-B1为该酶的反竞争性抑制剂,其K值为6.2μmol/L,IC50为29.5μmol/L,该化合物对于结核分枝杆菌H37Rv的MIC为32μg/mL.结论 成功构建了稳定性好、灵敏度高的结核分枝杆菌1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂的高通量筛选模型,筛选得到具有抗结核活性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂,为获得全新作用靶点的新型抗结核药物奠定了基础.
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异柠檬酸裂解酶的制备及其抑制剂筛选模型的建立
目的 制备结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)并建立ICL抑制剂筛选模型.方法 通过四步层析法或金属螯合层析法纯化大肠埃希菌BL21(DE3)表达的ICL,并以异柠檬酸为底物,用纯化的ICL裂解舁柠檬酸,生成乙醛酸可与苯肼反应生成苯腙,苯腙在324nm波长下产生光吸收峰,测定酶促反应体系在324nm波长下光吸收检测异柠檬酸裂解酶的活性,根据待测样品对酶活性的抑制程度,筛选异柠檬酸裂解酶抑制剂.结果 用金属螯和层析法得到纯度为90%、比活力为2.8U/mg的ICL,建立并优化ICL抑制剂筛选模型,模型的信噪比(S/N)远大于3,变异系数(CV)远小于10%.结论 通过金属螯合层析法获得了特异性高、稳定性好的ICL抑制剂筛选模型,该模型可有效的应用于异柠檬酸裂解酶抑制剂的高通量筛选.
关键词： 柠檬酸裂解酶 筛选模型 异柠檬酸裂解酶抑制剂 高通镀筛选 -
血管紧张素转化酶抑制剂体外筛选模型的建立
目的:本文通过紫外法与荧光法测定血管紧张素转化酶(ACE)活性,建立血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)的体外筛选模型.方法:采用紫外法和劳光法测ACE的活性.结果:两种方法均有良好的线性关系,测定卡托普利对ACE活性的抑制作用结果相符.荧光法避免了样品色素的干扰,可测定丹参提取液对ACE的抑制作用.结论:本筛选模型采用微量法,用酶标板进行测定,操作简便、快速、节约试剂和样品,具有高效、快速、可靠的特点.
关键词： 血管紧张素转化酶抑制剂 筛选模型 紫外法 荧光法 卡托普利 -
中性红法检测巨噬细胞吞噬功能的实验条件的优化
目的:优化中性红法检测巨噬细胞(Mψ)吞噬功能的实验条件,为快速筛选Mψ吞噬功能调节成分提供更为稳定的细胞模型.方法:以小鼠腹腔Mψ吞噬中性红的能力作为模型检测指标,考察细胞收集方法、细胞浓度、贴壁孵育时问、培养时间、LPS浓度、中性红浓度、检测波长等因素对检测结果的影响,优化中性红法检测Mψ吞噬功能的实验条件.结果:本实验条件下,PBS等三种清洗液收集小鼠腹腔Mψ的效率没有显著性差异(P>0.05);Mψ贴壁孵育时间以3h为宜;Mψ加样浓度可选择在2～8×106/ml范围内;LPS在30μg/ml时达到佳刺激效应;中性红浓度选择0.09%能够满足检测要求;加入中性红后的反应时间以3h的OD值高:检测波长以520nm时OD值高.结论:优化中性红法检测Mψ吞噬功能,对快速筛选Mψ吞噬功能调节成分具有实用价值.
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抗β-淀粉肽损伤PC12细胞活性物质的筛选研究
目的:建立便捷有效的筛选方法用于抗β淀粉肽损伤PC12细胞活性物质的筛选.方法:以不同浓度的β-淀粉肽与PC12细胞作用不同的时间,通过MTT法检测细胞存活率,确定合适的条件,建立淀粉肽损伤PC12细胞模型.以维生素E作为阳性对照,对选取的20个样品进行筛选.结果β-淀粉肽损伤PC12细胞模型稳定性较好,发现银杏叶粗提物具有抗β-淀粉肽损伤PC12细胞的活性.结论:该工作为开展抗β淀粉肽损伤PC12细胞活性物质的筛选提供了简便有效的筛选模型.
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慢病毒转染荧光蛋白 EYFP-H148Q/I152 L细胞模型的构建
目的：构建稳定表达EYFP荧光蛋白的 HeLa细胞作为阴离子（卤素）通道阻断剂筛选的细胞模型，为高通量筛选阴离子（卤素）通道阻断剂提供条件。方法通过基因重组技术构建表达YFP突变蛋白（EYFP‐H148Q／I152L）和puromycin抗性的慢病毒载体。将慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T 细胞产生慢病毒颗粒，感染HeLa细胞，进一步利用抗性基因对细胞进行puromycin筛选，纯化细胞并扩增至所需细胞量。采用实时定量PCR和Western blot方法检测目的基因EYFP‐H148Q／I152L的表达效率。并验证EYFP‐HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性。结果基因测序验证了目的基因成功插入慢病毒载体。RT‐PCR和Western blot检测结果显示，目的基因在 HeLa细胞中实现了过表达。荧光显微镜下观察到 EYFP‐HeLa稳转细胞株能够表达特有的EY FP黄色荧光，效率接近100％。碘离子（I－）（低渗）溶液刺激细胞阴离子（卤素）通道的开放，内流的I－能够使黄色荧光淬灭。结论构建的EYFP‐HeLa细胞系能够稳定表达EYFP黄色荧光蛋白，对内流入细胞的 I－敏感，可以作为理想的阴离子（卤素）通道阻断剂的筛选模型。
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抗Ⅰ型超敏反应药物筛选体外肥大细胞模型的建立
目前,由Ⅰ型超敏反应引发的疾病越来越多,如过敏性休克、花粉症(又称变态反应性鼻炎)、支气管哮喘等.在免疫学研究领域中对Ⅰ型超敏反应的研究是一个热点.在药物研究方面,寻找治疗Ⅰ型超敏反应的药物亦是一个重要的研究方向,目前对体内筛选研究较多.本课题的目的在于建立基于细胞水平上的体外快速筛选模型,用于筛选抗Ⅰ型超敏反应的药物,使药物筛选实现快速微量的目标.
