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蒜氨酸/蒜酶肠溶片质量控制方法研究
目的:建立一种新型片剂蒜氨酸/蒜酶肠溶片有效的质量控制方法.方法:采用TLC法对蒜氨酸/蒜酶肠溶片中的蒜氨酸、潜在大蒜辣素进行定性鉴别;采用HPLC法对制剂中的蒜氨酸、潜在大蒜辣素进行含量测定.结果:薄层色谱中蒜氨酸、潜在大蒜辣素特征斑点清晰;3批样品中蒜氨酸含量分别为55.24,49.60,54.90 mg/片,大蒜辣素含量分别为21.08,22.10,23.20 mg/片.辅料在整个研究中不干扰测定.结论:所建立质量控制方法可用于蒜氨酸/蒜酶肠溶片的质量控制.
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大蒜辣素前体包芯片的制备
目的:制备大蒜辣素前体包芯片,使其口服后在短时间内促发酶促反应,生成大蒜辣素.方法:以蒜氨酸和蒜酶双层片为片芯,控酸颗粒为外层压制得到包芯片.并以人工胃液为介质小杯法考察包芯片大蒜辣素产率.结果:大蒜辣素前体包芯片在人工胃液中10 min内大蒜辣素产率＞70％.结论:以蒜氨酸、蒜酶及控酸盐组合制备包芯片能够有效避免蒜酶在胃酸条件下失活,达到在体内获得较高产率大蒜辣素目的.
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大蒜蒜酶提取纯化及临床应用研究
目的:研究从鲜蒜中分离纯化蒜酶的方法和临床常用剂对酶活性的影响,为今后工艺的进一步放大、优化和合理临床应用提供必要理论参数.方法:以天然蒜氨酸作底物,采用丙酮酸法测定酶浓度;以牛血清白蛋白为标准,采用考马斯亮兰G-250法测定蛋白质浓度.结果:从鲜蒜中提取纯化蒜酶,其粗酶浸提液的佳组成为Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液;硫酸铵沉淀酶蛋白的适饱和度范围为0%～35%;选用超滤技术脱盐;蒜酶佳调节等电点为4.9.在临床常用溶剂中,含氯化钠的注射液(不含葡萄糖)对蒜酶活力有显著的激活作用,而含葡萄糖的注射液则较强地抑制了蒜酶活力;75%和95%乙醇具有强烈的杀酶作用.结论:本研究为今后工艺的进一步放大与优化和蒜酶合理临床应用提供了指导.
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高效液相色谱法考察蒜酶活力测定中的影响因素
目的 考察底物蒜氨酸纯度对蒜酶活力测定数值的影响,比较催化温度为25,35,37℃时蒜酶活力测定数值的差异.建立可行的蒜酶活力检测方法 .方法 采用高效液相色谱法,以蒜氨酸的减少量计算蒜酶活力.结果 进行蒜酶活力测定时,底物蒜氨酸的纯度应不小于90%,确定蒜酶催化反应温度为35℃.结论 建立了以95%蒜氨酸为底物,催化温度为35℃的蒜酶活力测定条件.
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蒜氨酸+蒜酶抗肿瘤及其机制的研究
大蒜制剂、大蒜提取物和大蒜提取成分的抗肿瘤作用已有广泛的研究[1].蒜氨酸( Alliin,2-烯丙基半胱氨酸亚砜)为大蒜活性成分的主要前体物质,蒜氨酸在蒜氨酸酶(Alliinase,EC 4.4.1.4)的催化作用下产生大蒜辣素(Allicin,二烯丙基硫代亚磺酸酯).本课题组发现蒜氨酸+蒜氨酸酶生成的大蒜辣素13 h内基本稳定.据此,本文采用MGC-803和HeLa肿瘤细胞株,利用蒜氨酸+蒜氨酸酶生成的大蒜辣素研究其体外的抗肿瘤作用及其作用机制.
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大蒜主要活性成分及药理作用研究进展
大蒜为广义百合科植物大蒜( Allium sativum L.)的鳞茎，具有防治心血管疾病、抗肿瘤及抗病原微生物等多方面的作用。该文通过查阅国内外文献，对大蒜的主要活性成分及药理作用进行综述，并针对国内大蒜研究中存在的问题和研究进展进行了初步的分析，为大蒜的进一步研究及新药开发提供一定的参考。
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大蒜蒜酶/蒜氨酸催化动力学及临床应用研究
目的 从鲜蒜中分离纯化蒜酶,并研究其酶学性质、动力学特性以及临床常用溶剂对酶活力的影响,为今后进一步优化蒜酶的提取纯化工艺和临床应用提供必要理论参数.方法 采用盐析、超滤、冷冻干燥等方法提取纯化蒜酶,SDS-Page凝胶电泳法测定纯化蒜酶分子量,丙酮酸法和考马斯亮蓝G-250法测定蒜酶活力.结果 分离纯化所得蒜酶的分子量为97.88 KDa,纯度大于60%;蒜酶催化裂解天然蒜氨酸的适温度为35℃,适pH为7.00;随着温度的升高,蒜酶的稳定性下降;蒜酶在pH 6.5的缓冲体系中稳定;以天然蒜氨酸为底物测得米氏常数Km=2.139 mmol·L-1,大反应速度Vmax=41.67 U·mg-1(蛋白);临床常用溶剂0.9%氯化钠注射液、复方氯化钠注射液(含0.85%NaCl、0.03%KCl、0.033%CaCl2)对蒜酶具有显著的激活作用,而5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液(含5%葡萄糖、0.9%氯化钠)则较强的抑制了蒜酶活力,75%和95%乙醇具有强烈的杀酶作用.结论 蒜酶具有热不稳定性和pH不稳定性;其酶解反应选择在35℃和pH 7.00的缓冲体系中佳;而蒜酶溶解在pH6.5的缓冲体系中能较长时间保持稳定;临床常用溶剂中,含氯化钠的注射液(不含葡萄糖)对蒜酶活力有显著的激活作用,而含有葡萄糖的注射液强烈抑制蒜酶活力;75%和95%乙醇作为消毒液使用时也应避免其对蒜酶的杀伤作用.实验结果对进一步优化蒜酶的提取纯化工艺研究以及蒜酶的临床应用具有指导意义.
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蒜氨酸+蒜酶共同作用对环磷酰胺处理小鼠免疫功能的调节作用
目的 观察蒜氨酸+蒜酶对环磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的调节作用.方法 环磷酰胺造模法制作免疫抑制小鼠模型,给药10 d,测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、血清溶血素、脾淋巴细胞增殖功能及血清IL-2含量,观察蒜氨酸+蒜酶对小鼠免疫功能的影响.结果 与模型组比较,蒜氨酸+蒜酶在中、高剂量可明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率,也可促进血清溶血素形成和脾淋巴细胞的增殖,高剂量可提高血清IL-2含量.结论 蒜氨酸+蒜酶对环磷酰胺处理小鼠免疫功能低下有免疫保护作用.
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多聚乙二醇化f蒜酶的特性研究
采用酶活性测定及双扩散法研究了蒜酶及修饰度为53%的多聚乙二醇(PEG)化蒜酶的某些理化性质、抗原性和免疫原性及在体外和小鼠体内的活性半衰期.结果显示:在75%的乙醇中,蒜酶完全失活,而PEG化蒜酶仍保持了50%的活性.蒜酶和PEG化蒜酶适温度均为40C.与蒜酶相比,PEG化蒜酶在更宽的pH范围内具有催化活性,蒜酶的适pH为7,而PEG化蒜酶在pH为6～7范围内均具有强的催化活性.蒜酶与其抗血清形成明显沉淀线,而PEG化蒜酶既不与蒜酶的抗血清也不与自身的抗血清形成沉淀.在血清中PEG化蒜酶的半衰期为90 h,是蒜酶的45倍.PEG化蒜酶的小鼠体内半衰期达2.58 d,而蒜酶在小鼠体内30 min后,已测不出催化活性.多次应用PEG化蒜酶的小鼠体内,相邻两次应用的PEG化蒜酶半衰期无显著性差异.
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大蒜中含硫化合物开发为硫化氢供体药物展望
大蒜是我国传统中药，含硫有机化合物是大蒜的主要活性成分。胱硫醚γ裂解酶/硫化氢（CSE/H2S）体系失调与心脑血管发病机制密切相关。大蒜含硫化合物作为外源性H2S供体或参与内源性H2S生成进而影响CSE/H2S体系而发挥心血管效应。本文通过查阅国内外文献，对大蒜含硫化合物心血管效应及其与CSE/H2S体系的关系进行综述，为大蒜含硫化合物开发为具备心血管效应的H2S供体药物提供一定的参考。
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片剂成型对蒜酶稳定性的影响
目的 研究片剂成型对蒜酶稳定性的影响.方法 以Heckel方程评价蒜酶的压缩成型性,研究成型过程中压力、填充剂、崩解剂及水分含量等因素对蒜酶活性的影响.结果 蒜酶在压缩成型过程中主要发生弹性形变,可压性较差.蒜酶的活性开始随压力升高而降低,在720 Mpa时活性达到低,继续增加压力后活性基本保持不变,表明压力可能是通过改变空间位阻使蒜酶的构象发生改变,进而影响其活性.填充剂和崩解剂均能缓解蒜酶活性的降低;一定的水分含量有助于蒜酶片剂的稳定.结论 蒜酶压缩成型性较差且不稳定,塑性填充剂、崩解剂可改善其压缩行为,增强片剂的稳定性.
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蒜氨酸、蒜酶及其混合物的体外抗氧化活性研究
研究蒜氨酸、蒜酶及其混合物的体外抗氧化活性.方法建立超氧阴离子自由基(·O2-)和羟基自由基(·OH)产生体系,应用Fe2+引发的卵磷脂过氧化体系,分别采用羟胺法、水杨酸法及硫代巴比妥酸法测定蒜氨酸、蒜酶及其混合物对·O2 -和·OH的清除能力及抗脂质过氧化能力.结果蒜氨酸,蒜酶及其混合物对·O2 -和·OH具有良好的清除作用,其大清除率分别为40.94％、55.75％、88.47％及21.65％、99.38％、98.72％；对脂质过氧化有良好的抑制作用,大抑制率分别为10.82％、33.88％、79.88％.结论蒜氨酸、蒜酶及其混合物有较强的体外抗氧化活性,混合物比分别单独使用的抗氧化作用.更强.
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蒜氨酸、蒜酶及蒜氨酸+蒜酶对白假丝酵母菌生长的影响
目的 检测蒜氨酸、蒜酶及蒜氨酸+蒜酶对白假丝酵母菌的体外抑菌作用.方法 采用液体稀释法、平板计数法测定三者对白假丝酵母菌的低抑菌浓度(MIC)、低杀菌浓度(MBC),并采用菌落法绘制时间-杀菌曲线.结果 蒜氨酸和蒜氨酸+蒜酶均可抑制、杀伤白假丝酵母菌,MIC分别为50、1.56 mg·mL-1,MBC分别为100、3.12 mg·mL-1;而蒜酶单体无此作用.结论 蒜氨酸和蒜氨酸+蒜酶均对白假丝酵母菌有抑菌作用.
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蒜氨酸和蒜酶临床前药学研究的管理学研究
新药研究不单是一个实验研究,还不可避免地牵涉到管理研究,管理研究的目的是保障试验研究符合法律法规和技术指导原则的规定.本文介绍了美国、欧盟、日本和我国对新药研究法规层面和技术层面的管理规定,梳理出对蒜氨酸和蒜酶的药学研究需要从管理角度研究的内容,并提出药学研究的三点实施原则,以便为蒜氨酸和蒜酶的药学研究提供管理上的支持.
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蒜氨酸+蒜酶诱导人胃腺癌细胞凋亡及其分子机制的研究
目的:观察蒜氨酸+蒜酶诱导人胃腺癌细胞(MGC-803)的凋亡作用,并进一步研究Bcl-2、Bax和p21基因在此过程中的作用.方法:将不同浓度的蒜氨酸+蒜酶作用于MGC-803细胞,观察其时间和剂量效应;利用光镜和荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯状带形成;利用RT-PCR法观察蒜氨酸+蒜酶作用过程中Bcl-2、Bax和p21基因的mRNA表达变化.结果:蒜氨酸+蒜酶可抑制MGC-803细胞的生长,存在时间和剂量关系;蒜氨酸+蒜酶可诱导MGC-803细胞凋亡;出现Bcl-2基因mRNA表达下调,Pax和p21基因mRNA个别剂量点的表达.结论:蒜氨酸+蒜酶诱导人胃腺癌细胞MGC-803的凋亡,其机理可能在于Bcl-2基因mRNA表达下调.
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蒜氨酸+蒜酶抗肿瘤功效的实验研究
目的:观察蒜氨酸+蒜酶体外抗肿瘤功效的活性,研究其可能的作用机制.方法:将不同浓度的蒜氨酸十蒜酶作用于M(GC-803和HeLa细胞,测定细胞存活量和活细胞蛋白含量,确定蒜氨酸+蒜酶对肿瘤细胞的抑制作用;通过流式细胞仪观察蒜氨酸十蒜酶对肿瘤细胞增殖的影响;利用光镜和荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯状带形成.结果:蒜氨酸+蒜酶可抑制MGC-803和HeLa细胞,中低剂量的蒜氨酸+蒜酶有促进蛋白合成的作用;蒜氨酸十蒜酶使MGC-803和HeLa细胞于S期阻滞,其中以对MGC-803细胞的S期阻滞明业;蒜氨酸+蒜酶可诱导MGC-803和HeLa细胞凋亡.结论:蒜氨酸+蒜酶体外具有抗肿瘤的活性,其机理可能在于诱导肿瘤细胞的凋亡和促进肿瘤细胞的分化.
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SDS-PAGE法测定蒜酶相对分子质量及含量
目的 采用还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法测定蒜酶的相对分子质量及含量.方法建立测定蒜酶的凝胶电泳条件:分离胶 12％,浓缩胶 5％,初始电压 80 V,进入分离胶时电压调至 100 V,测定经提取纯化后的蒜酶和大蒜样品中蒜酶的分子质量及含量.结果 通过 SDS-PAGE法确定以磷酸盐缓冲液为溶剂,蒜酶供试品浓度 27.2 mg/mL 进行蒜酶含量和相对分子质量测定;蒜酶供试品中蒜酶平均相对分子质量50.84 KDa,蒜酶供试品中蒜酶在总蛋白条带中平均相对含量为 52.39％,大蒜中蒜酶在总蛋白条带中平均相对含量为 6.28％.结论 SDS-PAGE法测定蒜酶含量及其相对分子质量,方法简便易行、结果准确可靠.
关键词： 蒜酶 大蒜 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法 -
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法同时测定不同产地大蒜药材中的蒜酶与凝集素
目的:建立SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳同时测定不同产地大蒜药材中蒜酶与凝集素相对含量和相对分子质量的方法.方法:通过考察溶媒方法、样品前处理方法、供试品溶液浓度等因素,确定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蒜酶与凝集素的佳条件:以超纯水为溶媒,静置10 min为前处理方法,供试品溶液质量浓度为28 mg· mL-1;分别配制5％浓缩胶、12％分离胶,凝胶厚度为1 mm,浓缩胶电压为80V,分离胶电压为100 V,进行不连续体系垂直板电泳,借助Gel-pro Analyzer软件分析凝胶电泳图谱.以标准蛋白为marker,建立标准曲线,将蒜酶和凝集素的比移值代入标准曲线方程,计算蒜酶和凝集素的相对分子质量.结果:标准曲线方程为lgM=-1.369 1X+2.184 7,r=0.966 6.大蒜药材中蒜酶相对分子质量为52.1～54.0 kDa,凝集素相对分子质量为11.0～11.8 kDa.不同产地大蒜药材中蒜酶和凝集素总相对含量为18.1％～77.2％,其中蒜酶的相对含量为5.60％～27.1％,凝集素的相对含量为12.5％～68.2％.新疆巴里坤市大蒜样品中蒜酶的相对含量高为27.1％,新疆阿克苏拜城县大蒜样品中凝集素的相对含量高为68.2％.不同产地大蒜药材中蒜酶、凝集素的相对含量存在差异,凝集素相对含量普遍高于蒜酶相对含量.结论:与其他测定蛋白质含量的方法相比,本文建立的方法操作简便,样品用量少,能够准确测定大蒜药材中蒜酶及凝集素的相对分子质量与相对含量.不同产地大蒜中蒜酶与凝集素相对总合量均达50％以上,证明蒜酶和凝集素是大蒜中的主要蛋白质.大蒜中的蒜酶与蒜氨酸相对含量的相关性并不显著.
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有关2010年版中国药典大蒜质量标准的几点建议
通过文献综述阐述大蒜的活性成分——蒜氨酸、蒜酶和大蒜辣素及三者之间的关系；介绍国外药典收载大蒜及相关制剂含量测定的指标,简述大蒜素的由来及结构.对2010年版中国药典大蒜质量标准中含量测定的方法提出疑问,并提出修改建议.
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大蒜质量标准中商榷内容的研究
目的:参照美国药典、欧盟药典和英国药典对2010版中国药典收载的大蒜薄层鉴别和含量测定等进行研究.方法:采用微波灭酶法处理样品,对大蒜药材进行薄层色谱鉴别；采用阳离子交换色谱柱,以磷酸盐缓冲溶液为流动相,流速0.5 mL· min-1,检测波长214nm,测定大蒜药材中蒜氨酸含量.结果:不同产地大蒜药材的薄层色谱在与蒜氨酸和精氨酸对照品斑点Rf值相同的位置上,均检出相同的斑点.建立的蒜氨酸含量测定HPLC法,经方法学实验表明,蒜氨酸浓度在31.2～374.4μg·mL-1范围内呈良好线性关系(r=0.9999)；低、中、高浓度平均回收率(n=9)分别为102.8％( RSD=4.0％),101.8％( RSD=3.0％),111.0％ (RSD =3.8％).结论:本研究建立了大蒜药材的薄层色谱鉴别和高效液相色谱含量测定方法,可用于大蒜药材的定性与定量分析,建议作为大蒜质量标准进一步研究的参考.
