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己烯雌酚对人肝微粒体内CYP3A4和CYP2C9酶的抑制作用
目的:体外实验考察己烯雌酚(DES)对细胞色素P450 3A4(CYP3A4)和细胞色素P450 2C9(CYP2C9)活性的抑制作用,以评佑DES通过抑制这两个重要的细胞色素P450(CYP)亚型而引发药物-药物相互作用的可能性.方法:混合人肝微粒体与不同浓度的DES(或阳性抑制剂),CYP3A4或CYP2C9的探针底物在37℃条件下孵育相应的反应时间后,用高效液相色谱-紫外吸收法观察探针底物的代谢产物的生成率,计算IC50值.选取不同的探针底物浓度(覆盖Km值)和DES浓度(覆盖IC50值)测定出相应的代谢速率,用Lineweaver-Burk作图和Dixon作图来判断可逆抑制类型,计算抑制动力学参数K.单点失活法测定DES对CYP3A4和CYP2C9是否有基于机制的抑制.结合Ki值和DES的大血药浓度(Cmax)预测体内产生的药物-药物相互作用.结果:DES对CYP3A4和CYP2C9体现出浓度依赖型的抑制,相应的IC50值分别为7.4±1.0和(3.8±0.1)μmol·L-1.DES对CYP3A4和CYP2C9抑制的Dixon作图的交点都在第二象限,而Lineweaver-Burk作图的交点都在纵轴上,这两方面证据共同证实DES对CYP3A4和CYP2C9抑制属于竞争型抑制.CYP3A4和CYP2C9的Ki值分别为4.4和3.0μmol·L-1.DES对CYP3A4和CYP2C9不存在基于机制的抑制.利用DES的Cmax计算出时CYP3A4和CYP2C9代谢底物AUC变化倍数分别为4.3和6.2.结论:DES对CYP3A4和CYP2C9的活性有较强的抑制作用,在临床常用的剂量条件下,很容易诱导药物-药物相互作用.
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人细胞色素P450 3A4突变体CYP3A4.3, CYP3A4.4, CYP3A4.5和CYP3A4.18重组酶的异源表达与活性
目的 重组表达人细胞色素P450(CYP)3A4突变体CYP3A4.3, CYP3A4.4, CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白,为CYP3A4代谢活性的体外研究提供单一酶源.方法 应用杆状病毒表达系统构建含有上述各CYP3A4突变体基因序列的重组病毒,将其连同含人源还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-P450氧化还原酶(POR)和细胞色素b5基因的重组病毒共同感染昆虫草地夜蛾细胞Sf9得到CYP3A4突变体与POR和细胞色素b5共表达的重组蛋白,分别以高效液相色谱法和荧光分析法测定各重组酶对睾酮和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素的代谢活性.结果 在mRNA分子水平上验证了CYP3A4突变体CYP3A4*3, CYP3A4*4, CYP3A4*5和CYP3A4*18基因在Sf9细胞中的转录.感染了各重组病毒的Sf9细胞裂解液对睾酮和7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素有明显代谢.结论 应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统在体外成功表达了具有催化活性的人CYP3A4突变体CYP3A4.3, CYP3A4.4, CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白, 其中CYP3A4.5活性显著低于野生型蛋白,CYP3A4.18活性显著高于野生型蛋白,而CYP3A4.3和CYP3A4.4与野生型蛋白活性近似.
关键词： 细胞色素P450 CYP3A4 突变 杆状病毒科 睾酮 -
用于药物研发的细胞色素P450酶3A4体外肝细胞模型的研究进展
药物研发中生理性功能的体外细胞模型是非常重要的.细胞色素P450酶3A4 (CYP3A4)是重要的临床药物代谢酶之一,其作用底物谱广泛.相应地由这些底物作用于CYP3A4酶而产生的酶活性被抑制或诱导,直观表现为复杂化的药物代谢相互作用.因此,CYP3A4体外细胞模型在药物研发过程中具有重要应用价值.目前常用CYP3A4表达的一些体外模型,相比体内有不同程度的差距.这些差距有望通过加深机制了解、基因工程学技术以及体外微环境模拟功能单元构建组织工程技术的进步,而逐步得以缩减或消除.如何构建接近生理性表达的体外CYP3A4细胞模型是本研究领域一直探索的热点.本文就目前已知的CYP3A4生理功能特征、表达调控机制以及基于已知相关机制研究进行体外细胞模型构建的细胞种类、构建策略和方式进行综述.
关键词： 细胞色素P450 CYP3A4 肝细胞 体外 -
CYP3A4基因多态性对阿立哌唑血药浓度及精神分裂症临床疗效的影响
目的 研究细胞色素P450酶CYP3A 4*4和CYP3A4*18B基因多态性对阿立哌唑血药浓度及临床疗效的影响,探讨阿立哌唑在不同个体间代谢差异的遗传背景.方法 符合诊断标准的84例精神分裂症患者接受阿立哌唑(10 ～ 30 mg·d-1)为期4周的治疗,应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性方法(PCR-RFLP)检测84例患者CYP3A 4*4和CYP3A 4* 18B基因多态性,采用反相高效液相色谱法测定阿立哌唑的谷血药浓度,并在治疗第0、2、4周分别进行阳性与阴性症状量表(PANSS)评分.结果 在考察的84例患者中,CYP3A 4*4未见突变；CYP3A4*18B基因*1/*1型有46例(55％),*1/*18B型34例(40％),*18B/*18B型4例(5％).CYP3A 4* 18B基因型可影响血药浓度/剂量比,*1/*1型的血药浓度/剂量比高,*1/*18B型次之,*18B/*18B型低,*1/*1型与*18B/*18B型患者之间有显著差异(P ＜0.05),其余各组间未见显著差异(P＞0.05).不同基因型之间治疗2周和4周的临床疗效均未见显著差异(P＞0.05).结论 CYP3A4* 18B基因多态性可影响阿立哌唑的血药浓度,但并不能确定与阿立哌唑的临床疗效有关.
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注射用盐酸头孢他美对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响
目的 研究注射用盐酸头孢他美对大鼠肝微粒体细胞色素P450(CYP450)酶系CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响.方法 将SD大鼠分成盐酸头孢他美给药组和生理盐水空白组,每组6只,雌雄各半,给药组尾静脉注射盐酸头孢他美50mg/(kg·d),连续给药7d,每天2次.HPLC法同时测定CYP450的3种同工酶特异性探针底物在SD大鼠肝微粒体内代谢产物生成量和原型探针底物降解量,判断酶亚型活性变化.分析柱Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5μm),流速1.0 mL/min.CYP1A2代谢样品测定条件为甲醇(0.1％甲酸)(A)-水(0.1％甲酸)(B),0～5 min:18％A,5～10 min:18％～60％A,10～15 min:60％A,检测波长为247 nm; CYP3A4代谢样品测定条件为甲醇(A)-水(0.02％甲酸)(B),0～11 min:40％～60％A,检测波长为223 nm;CYP2E1代谢样品测定条件为甲醇(A)-水(B),0～10 min:37％～75％A,检测波长为287nm.结果 探针底物及其代谢产物在测定浓度范围内线性关系良好(r≥0.999 7),精密度RSD＜6％(n=5),提取回收率83.2％～97.5％.SD大鼠连续注射给予盐酸头孢他美后,CYP3A4的活性与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),可能存在诱导作用;CYP1 A2和CYP2E1的活性与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 静注给予盐酸头孢他美能诱导SD大鼠肝微粒体CYP3A4,对CYP1A2和CYP2E1没有诱导或抑制作用.提示经CYP3A4代谢的药物在临床上与注射用盐酸头孢他美合用时,可能存在潜在药物-药物相互作用.
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肾移植受者C YP3A5*3和CYP3A4*18B对他克莫司药动学的影响
目的 探讨肾移植受者细胞色素P4 50酶(CYP)3A5*3、CYP3A4* 18B和CYP3A5-CYP3A4单倍型对他克莫司(Tac)药动学的影响.方法 采用DNA测序法检测61例肾移植受者CYP3A5*3和CYP3A4* 18B基因型.酶联免疫吸附试验测定受者的血Tac浓度,比较术后14d和1、2、3个月时不同基因型受者之间血Tac浓度谷值(G0)、Tac剂量(D)及浓度/剂量(G0/D)的差异.结果 61例中,CYP3A5*3和CYP3A4*18B等位基因突变频率分别为74.6％和26.2％.当CYP3A5表达(*1/*1+*1/*3)者的D是CYP3A5未表达(*3/*3)者的1.3～1.6倍时,未表达者的G0却是表达者的1.1～1.5倍,C0/D是表达者的1.8～2.4倍.CYP3A4* 18B(*1/*18B及*18B/* 18B)基因型者的D是CYP3A4*1/*1基因型者的1.2～1.5倍时,*1/*1基因型者的G0是* 18B基因型者的1.2～1.4倍,G0/D是*18B基因型者的1.5～1.8倍.当CYP3A5-CYP3 A4( AA-AA)者的D是CYP3A5-CYP3A4(GG-GG)者的1.3～1.7倍时,GG-GG的G0是AAAA的1.5～2倍,C0/D是AA-AA的2.5～3倍.当受者G0/D分别位于中位数上下时,CYP3A5、CYP3A4不同基因型和CYP3A5 CYP3A4不同单倍型受者的分布差异较大.结论 肾移植受者CYP3A5*3和CYP3A4* 18B基因多态性对Tac的药动学有显著影响,对CYP3A5 CYP3A4单倍型的分析比单独考虑一种基因型影响更为显著.
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中国人肝微粒体中细胞色素P450酶含量和活性的个体间差异
比较不同中国人肝微粒体中几种重要细胞色素P450(CYP)的酶含量和活性。方法：运用West-ern斑点分析和光密度扫描，对17个汉族、17个壮族和8个苗族受试者肝微粒体中的细胞色素P4501A2(CYP1A2)、2C9及3A4进行定量；非那西丁、甲磺丁脲、异喹胍和奥美拉唑分别用于体外测量CYPIA2、2C9、2D6及3A4的活性。结果：CYP1A2、2C9及3A4的含量和活性具有很大的个体间变异，另外CYP2D6的活性在各样本间也有很大差异；CYP3A4(32％)是中国人肝微粒体中含量丰富的CYP，CYP2C9(19％)和CYP1A2(16％)的含量也很可观；除了CYP1A2的含量和活性具有一定的种族和性别差异外，未发现其它CYP具有种族和性别差异；CYP1A2、2C9和3A4的酶蛋白含量分别和它们的活性具有很好的相关性。结论：我们的结果为在中国人中进行药物代谢研究提供了非常有价值的信息。
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体外研究人细胞色素P450在雌二醇代谢中的作用
目的:研究雌二醇在cDNA表达的P450和人肝微粒体中的代谢机制,为在体内研究细胞色素P450活性与肿瘤发生的关系提供依据.方法:用HPLC-ECD法测定雌二醇的代谢产物.通过雌二醇在不同cDNA表达的P450中代谢,13例人肝微粒体中相关性研究,抑制剂对代谢的影响以及微粒体中17β-羟基脱氢化和2-羟基化代谢的催化动力学的研究来推断雌二醇的代谢机理.结果:在cDNA表达的P450中,催化2-羟基化代谢的P450按活性排列依次为CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9.CYP2C9、CYP2C19和CYP2C8均具有较高的催化17β-羟基脱氢化活性.抑制CYP1A2与抑制CYP3A4对2-羟基化代谢产物生成的影响相似,可认为CYP1A2和CYP3A4在人肝微粒体中催化2-羟基化代谢的作用相近.雌二醇代谢的途径与底物浓度有关,低浓度时(1,10 μmol/L)17β-羟基脱氢化为主要代谢途径;高浓度时(100μmol/L),2-羟基化成为主要代谢途径.结论:高底物浓度时,雌二醇主要由CYP1A2和CYP3A4催化代谢为2-羟基化产物.低底物浓度时,主要由CYP2C9、CYP2C19和CYP2C8催化生成17β-羟基去氢化产物.
