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髋关节骨性关节炎的治疗经验
髋关节是人体负重的重要关节,随着年龄的增长,骨性关节炎的发病率增加,其确切的病因目前尚未完全明了,主要表现在老年人关节软骨的破坏,关节疼痛,活动障碍.大多数患者依靠长期服用非甾体类消炎镇痛药物缓解症状,但药物所致的胃肠道刺激症状伴随而来;人工关节置换疗效虽好但受诸多条件限制,从而,生活质量大大降低.随着我国人口老龄化的来临,如何使用方便、安全、有效的方法治疗老年人的髋关节骨性关节炎已成为众多骨科医师关注的问题.
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关节软骨损伤的治疗进展
关节软骨损伤是骨科较为常见的疾病.据统计,在行关节镜治疗者中,66%有关节软骨病变,11%有全层软骨损伤[1].目前普遍接受这样的观点:成年人关节软骨一旦损伤,其修复能力非常有限,直径<3咖可以部分或完全修复,直径>4 mm的缺损则很难自行修复[2].现将关节软骨损伤的治疗方法介绍如下.
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人关节软骨细胞的体外分离、培养与鉴定
目的:研究人关节软骨细胞的体外分离、培养及鉴定方法,观察各代人关节软骨细胞的形态学特性.方法:取人创伤性截肢的无菌膝关节软骨,采用两步酶消化法分离培养人关节软骨细胞,并进行传代培养.通过倒置相差显微镜下观察细胞形态,绘制生长曲线,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行鉴定.结果:两步酶消化法消化出的软骨细胞呈圆形,培养2-3天,细胞贴壁、变形,呈三角形或多角形,2周左右细胞融合成层,传代5次后出现去分化.软骨细胞增殖和生长缓慢.形态学、免疫组织化学染色显示细胞培养5代以内可以保持表型的稳定.结论:本研究采用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化法获得大量高纯度、高活性的人关节软骨细胞.5代以内细胞生长良好,生物学特性明显,适合于实验研究,5代以后出现去分化现象.
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优化底物酶及冻存剂组成对软骨细胞增殖力及活力的影响
[目的] 本文研究的目的在于找到软骨细胞分离的合适方法及优化冰冻保存软骨组织的配方.[方法] 来源于骨关节炎膝关节置换术的软骨标本被用于本次试验,采用300或400 u/ml Ⅱ型胶原酶(CTⅡ-1或2)进行软骨细胞体外分离,保存在不同组成的冷冻剂中,进行梯度冷却并保存在液氮中48h,随后进行软骨细胞活力及增殖潜力的测定.[结果] CTⅡ-1较CTⅡ-2更能分离出高活力的软骨细胞(P＜0.05),并且300或400 u/ml的底物酶浓度比较合适.10％ DMSO +90％ FCS是一种比较合适的冰冻保护剂,能够大程度保留软骨细胞的增殖潜力与活力,并且毒副作用小.[结论] 通过相关的优化措施诸如软骨细胞体外分离底物酶以及冰冻保护剂的组成,从关节软骨组织中分离具有高增殖潜力的活力软骨细胞是一种可行的方法.
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人异体骨软骨移植物保存方法研究
[目的]探讨六种保存方法对人关节软骨组织结构和细胞活性的影响,寻求一种保存效果较好的方法,为临床提供一种有活性的异体骨软骨移植物.[方法]自捐献新鲜尸体膝关节利用专用手术器械获取4.5 mm ×4.5 mm大小的人骨软骨块,分别采用梯度降温法、Co60射线照射+梯度降温法、玻璃化法、连续降温法、直接液氮法和酒精浸泡法对软骨块进行保存处理,分别于保存第8、15、30、60d时,采用蕃红-O组织染色、扫描电镜、软骨细胞胎盼蓝染色、MTT法等,观察并比较以上6种方法保存后关节软骨细胞存活率及其代谢功能变化.[结果]除了酒精保存方法外,其余保存方法随着时间延长软骨组织的细胞成活率和细胞代谢活性逐渐降低；保存60d时,采用玻璃化法保存软骨组织的细胞存活率为62.47％,软骨基质成分丢失较少,胶原纤维断裂不明显；采用慢速梯度降温法保存软骨组织的细胞存活率为59.75％,软骨基质成分丢失较多,胶原纤维断裂明显；其他保存方法软骨细胞存活率不足40％,软骨基质成分大量丢失,胶原纤维杂乱.[结论]六种保存方法中,玻璃化保存法能够较好的保存关节软骨,活性好,其次是梯度降温保存法,两者均具有一定临床价值.Co60射线照射对软骨细胞有一定的损伤作用；酒精浸泡不能保存软骨细胞活性.
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骨性关节炎与软骨细胞凋亡的关系
骨性关节炎(OA)重要的病理学特征是关节软骨的降解.既往对OA的研究,大多着重于细胞外基质酶性降解和/或合成新的基质受到抑制而导致软骨的破坏,很少注重软骨细胞生存或死亡在OA关节软骨降解中所起的作用.软骨细胞是成熟软骨中唯一的细胞类型,关节软骨与年龄有关的变化包括细胞数减少,空陷窝增加,异常基质钙化.细胞数量上的变化与软骨纤维化增加的频率一致[1,2],这提示细胞结构的减少成了基质降解及OA终发生的因素.一个重要的现象是OA患者关节中正常软骨及非负重区软骨中的软骨细胞数少于正常人关节软骨中的软骨细胞数[3].Weiss在20年前发现退化的软骨细胞数随OA严重程度增加而增加.他所描述的退化关节软骨细胞具有今天认定的凋亡细胞形态特征[4,5].
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人关节软骨来源CD105~+/CD166~+间充质干细胞的分选及其多向分化特性的鉴定
目的 建立免疫磁珠技术高效分选人关节软骨CD166~+/CD105~+间充质干细胞(MSCs)的方法,并鉴定其多向分化特性.方法 酶消化法获取5例手术切除的膝关节软骨组织细胞,并行原代(P~0代)和传代(P~2、P~4、P~6代)培养;流式细胞仪检测其中CD166~+/CD105~+细胞百分比.比较免疫磁珠连续法与间断法分选P~4代培养细胞中CD166~+/CD105~+细胞的所需时间、分选细胞活度及其百分比和收获率.对连续法分选CD166~+/CD105~+细胞进行成骨、成软骨、成脂肪诱导,Gomori钙钴法碱性磷酸酶(Ale)、Ⅱ型胶原免疫组化、油红O染色检测其分化特性.结果 人关节软骨组织分离细胞和原代培养细胞中的CD105~+/CD166~+细胞百分比较低[(1.13±0.68)%、(5.16±3.59)%],传代培养细胞中的CD105~+/CD166~+细胞百分比随传代次数增加而明显增高[P~2、P~4、P~6代培养细胞中CD166~+/CD105~+细胞百分比分别为(12.68±2.59)%、(17.81±3.80)%、(19.36±3.93)%](P<0.05),传代培养至P~4代,其CD105~+/CD166~+细胞百分比与P~6代[(19.36±3.937)%]比较差异不显著(P>0.05).免疫磁珠连续法分选P4代培养细胞中CD105~+/CD166~+细胞的百分比高于间断分选法[(93.8±3.95)%vs(90.1±2.43)%,P<0.05],且分选时间显著缩短[(6.8 ±0.40)h vs (120.0±10.21)h,P<0.01),而细胞收获率[(62.0±7.5)% vs (68.5±7.0)%]和细胞活度[(93.8±1.48)% vs (94.6±1.14)%1差异不显著(P>0.05).连续法分选CD166~+/CD105~+细胞成骨诱导后ALP染色阳性;成软骨诱导前Ⅱ型胶原弱阳性,诱导后Ⅱ型胶原附性;成脂肪诱导后,细胞内可见脂肪滴,油红O染色阳性.结论 人关节软骨P~4、P~6代培养细胞中的MSCs比例较高.免疫磁珠连续法能够高效了分选人关节软骨MSCs,所分选的MSCs具有成骨、成软骨及成脂肪分化功能.
关键词： 人关节软骨 CD166~+/CD105~+ 间充质干细胞 免疫磁珠 细胞分选
