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分子伴侣在F275S KCNQ1基因突变导致内质网滞留的作用
目的:探讨分子伴侣在F275S KCNQ1 基因突变导致内质网滞留中的作用,明确先天性长QT 综合征的发病机制.方法:利用Effectene 转染试剂介导将pcDNA3.1-F275S KCNQ1 和pcDNA3.1-KCNE1 共转染HEK293 细胞.然后,采用RT-PCR 和Western Blot 分析,检测转染细胞内分子伴侣GRP94、GRP78、CHOP 和XBP1 的表达变化.结果:RT-PCR 和Western Blot 结果显示,与野生型和空白对照组相比,突变型转染组GRP94 和GRP78 在mRNA 和蛋白水平表达均明显增加(P<0.05),而CHOP 和XBP1 mRNA 表达无明显差异(P>0.05).结论:GRP94和GRP78 参与了F275S KCNQ1 突变基因导致的编码蛋白内质网滞留.
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C末端缺失NR2B亚单位表达载体的构建及其在NMDA受体装配研究中的应用
目的:研究NMDA受体NR2B亚单位细胞内C末端,在NR1-1a/NR2B亚型NMDA受体装配和表面表达中的作用.方法:构建C末端不同缺失和GFP标记的NR2B亚单位表达载体,单独转染或与NR1亚单位共转染到HEK293细胞,用抗GFP多克隆抗体和Cy3荧光素交联的二抗作活细胞表面受体染色.结果:成功构建了8个C末端不同缺失的GFP-NR2B表达质粒(GFP-NR2BΔ1～Δ8).将GFP-NR1-1a,GFP-NR2B及GFP-NR2BΔ1～Δ8分别单独转染HEK293细胞,不能获得达细胞膜表面的表达.而将这些质粒分别与NR1-1a共转染293细胞,发现GFP-NR2B及C末端部分缺失的GFP-NR2BΔ1～Δ6,均能与NR1-1a一起表达于细胞膜表面,而仅留有PDZ结合基序的GFP-NR2BΔ7和C末端全长缺失的GFP-NR2BΔ8,则不能与NR1-1a一起表达于细胞膜表面.结论:NR1-1a与NR2B的共表达和装配,是形成NR1-1a/NR2B亚型NMDA受体并表达于细胞表面的必要条件.NR2B与NR1-1a装配时,NR2B对NR1-1a C1盒中内质网滞留基序的遮蔽和阻滞作用,并不依赖于NR2B C末端某一特定的区域,相反可能仅要求有一定长度的NR2B C末端.
关键词： 受体 N-甲基-D-天冬氨酸/分析 NR2B亚单位 膜表面表达 内质网滞留 -
NMDA受体NR2A亚单位C末端突变体在HEK293细胞的共表达研究
目的:研究N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体NR2A亚单位的细胞内羧基端在受体装配和表面表达中的作用.方法:构建N末端GFP标记、C末端不同区域缺失的NR2A亚单位表达载体GFP-NR2AΔC1～GFP-NR2AΔC5,其C末端缺失区依次分别为897L-1017S、1024D-1142P、1149D-1347G、1354S-1464V和897L-1464V.将它们单独转染或与NR1亚单位共转染到HEK293细胞,用抗GFP多克隆抗体和Cy3荧光素交联的二抗作活细胞表面受体染色.结果:成功构建了5个C末端不同区域缺失的GFP-NR2A表达质粒GFP-NR2AΔC1～GFP-NR2AΔC5.将这些载体分别单独转染HEK293细胞,均不能获得达细胞膜表面表达.而将这些质粒分别与NR1-1a共转染HEK293细胞,发现它们均能与NR1-1a表达于细胞膜表面.结论:NR1-1a与NR2A的共表达是形成NR1-1a/NR2A亚型NMDA受体并获得细胞表面表达的必要条件.NR2A C末端897L下游并未找到直接与NR1-1a C1盒中内质网滞留基序相互作用的某一特定区域,也不含有决定NR2A亚单位本身细胞内滞留的区域.
关键词： 受体 N-甲基-D-天冬氨酸/分析 NR2A亚单位 内质网滞留 表面表达
