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磁共振成像评价腺病毒介导的酪氨酸酶基因在HepG2细胞的表达
目的 以酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞,以磁共振成像(MRI)观察酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染体外细胞的效果.方法 以不同数量酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞,以MRI T1加权像(T1WI)、T2加权像(T2WI)及短时间间隔反转恢复序列( STIR)扫描转染细胞.应用Masson-Fontana染色检测黑色素的合成,实时定量 PCR验证酪氨酸酶基因的转染与表达.结果 酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞并在其中表达生成黑色素,经转染复数分别为50、150、300的重组腺病毒转染的1×106个细胞内生成的黑色素能够被MRI检测到并在MRI T1WI、T2WI、STIR检查呈高信号.Masson-Fontana染色检测到转染的HepG2细胞内的黑色素颗粒;实时定量PCR在转染细胞中检测到的酪氨酸酶基因的cDNA表达量较未转染细胞的表达量明显增高.结论 MRI能够检测到HepG2细胞由外源基因表达合成的黑色素,表明腺病毒作为运送载体可以有效地运送酪氨酸酶基因进入HepG2细胞.
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眼皮肤白化病患者酪氨酸酶基因突变的研究
目的:对临床诊断为眼皮肤白化病(OCA)患者的酪氨酸酶(TYR)基因进行突变筛查,了解我国大陆OCA患者TYR基因突变类型,探讨基因突变对人TYR蛋白结构和功能的影响.方法:应用PCR技术,扩增患者及其父母的TYR基因外显子、外显子-内含子交界区及启动子区;以DNA序列测定技术,进行突变筛查与鉴定;利用生物信息学方法,对突变引起蛋白结构和功能的改变进行预测与分析.结果:在15名患者的30个TYR等位基因内,查明11种突变;其中错义突变5种(W400L、R299H、E294K、R77Q和K142M),无义突变3种(R116X、R278X和G295X),插入突变2种(929insC和232insGGG),剪切位点突变1种(IVS1-3 C > G);对4个突变W400L、R299H、929insC、232insGGG的生物信息学分析显示,突变的致病性与蛋白结构和功能的改变相关.结论:W400L占本研究所检出全部OCA1突变等位基因的30.0%(9/30),可能为中国大陆人群中较常见的TYR基因突变类型;应用生物信息学分析方法对TYR基因突变的致病性做出一些合理可能的解释是可行的.
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小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达
目的:克隆酪氨酸酶基因(TYR), 并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白, 体外测定纯化的TYR活性.方法:利用RT-PCR技术, 从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR, 克隆至pMD18-T载体, 进行双链核苷酸序列测定.构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaA- TYR并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115, 表达的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析, 采用Co2+离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性.结果:克隆了TYR基因.构建了重组表达质粒pPICZaA-TYR.SDS-PAGE和Western blot分析显示, 在相对分子质量(Mr)为约53 000处出现1条特异性蛋白带, 且能与兔抗TYR抗体发生反应.结论:克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致, 并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性.
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高良姜素对人黑素瘤A375细胞黑素合成及TYR、TRP-1、TRP-2mRNA表达的影响
目的 探讨不同质量分数高良姜素对人黑素瘤A375细胞黑素合成以及酪氨酸酶基因(TYR)、酪氨酸相关蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸相关蛋白-2(TRP-2) mRNA的影响.方法 选取人黑素瘤A375细胞,随机分为空白对照组、阳性对照组、90％高良姜素组和99％高良姜素组,其中阳性对照组、90％高良姜素组和99％高良姜素组各分为1.0,5.0和10.0 mmol/L组,每组给予相应浓度的含8-甲氧基补骨脂素、90％高良姜素和99％高良姜素的培养液,对照组给予等体积的培养液,采用MTT法测定细胞增殖情况,NaOH裂解法检测黑素合成情况,RT-PCR检测细胞TYR mRNA等表达情况.结果 相同浓度下,90％高良姜素组和99％高良姜素组A值均高于阳性对照组(均P＜0.05),且两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);10.0 mmol/L浓度下,90％高良姜素组和99％高良姜素组黑素水平分别为(170.12±0.07)％和(121.41±0.07)％,明显高于浓度为1.0 mmol/L和5.0 mmol/L浓度组(P＜0.05);相同浓度下,90％高良姜素组黑素水平明显高于99％高良姜素组(P＜0.05);在1.0 mmol/L浓度下,99％高良姜素组能显著上调TYP和TRP-2 mRNA表达,分别为(0.65±0.08)和(0.72±0.30),明显高于空白对照组以及相同浓度下90％高良姜素组(P＜0.05);在5.0 mmol/L浓度下,99％高良姜素组能显著上调TYP,TRP-1,TRP-2 mRNA表达,分别为(0.61±0.07)、(0.61±0.11)和(0.67±0.27),明显高于空白对照组以及相同浓度下90％高良姜素组(P＜0.05).结论 高良姜素对人黑素瘤A375细胞黑素合成及TYR,TRP-1,TRP-2 mRNA表达有所影响,其中99％高良姜素促进细胞黑素合成的能力弱于90％高良姜素,值得进一步研究.
关键词： 高良姜素 黑素合成 人黑素瘤A375细胞 酪氨酸酶基因 酪氨酸相关蛋白
