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miR-194慢病毒表达质粒的构建及对人骨肉瘤细胞系U2-OS转移的相关研究
目的：通过构建携带针对miR-194的慢病毒沉默及过表达载体，研究miR-194对骨肉瘤细胞转移的影响。方法：以miR-194前体及成熟体序列为模板，设计引物，进行PCR扩增，酶切后克隆于慢病毒载体plent-i GFP中，转染293T细胞，包装慢病毒颗粒，检测滴度，终对人骨肉瘤细胞系U2-OS进行感染。获取稳定感染细胞后，进行Transwell、划痕等实验。结果：1）慢病毒表达质粒构建成功，沉默表达及过表达重组慢病毒的滴度分别为4×108TU/mL及1.5×108TU/mL；2）稳定过表达miR-194的人骨肉瘤细胞系U2-OS的转移能力较其他组有明显降低（P<0.01）。结论：成功构建了miR-194慢病毒表达载体，miR-194的表达水平对U2-OS细胞的转移能力具有显著影响，miR-194可能成为骨肉瘤治疗的潜在新靶点。
关键词： 骨肉瘤 miR-194 慢病毒 成骨肉瘤细胞系U2-OS 转移 -
miR-194对人脑胶质瘤U87细胞恶性生物学行为的影响
目的 研究miR-194在人脑胶质瘤组织及人U87细胞中表达,以及其对U87细胞增殖、迁移、侵袭能力和凋亡率的影响.方法 应用实时荧光定量PCR方法分别检测23例人脑胶质瘤组织及5例对照脑组织(脑出血及外伤脑组织)中miR-194的表达水平;将miR-194激动剂、拮抗剂及其各自的空白对照分别转染至U87细胞中,应用CCK-8方法检测转染miR-194后U87细胞增殖能力;Transwell实验检测U87细胞迁移、侵袭能力.流式细胞技术检测转染miR-194后细胞凋亡率.结果 与对照组比较,人脑胶质瘤组织中miR-194表达量显著下调(P＜0.05);过表达miR-194后能够明显抑制U87细胞增殖、迁移及侵袭能力,并显著促进U87细胞凋亡.结论 miR-194在胶质瘤组织中表达下调,过表达miR-194能够显著抑制U87细胞增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡.
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长链非编码PCA3靶向miR-194影响前列腺癌细胞增殖和凋亡行为
目的:探讨长链非编码PCA3靶向miR-194的表达通过ERK信号通路对前列腺癌细胞增殖和凋亡的作用及机制.方法:qPCR检测PCA3和miR-194在不同前列腺癌细胞中的表达情况;双荧光素酶报告基因检测PCA3与miR-194的相互作用;克隆形成实验和凋亡实验检测抑制PCA3后前列腺细胞增殖能力和凋亡行为的变化,及过表达miR-194后前列腺细胞增殖能力和凋亡行为的变化;Western blot检测抑制PCA3后ERK信号通路蛋白的表达水平及过表达miR-194后ERK信号通路蛋白的表达水平变化.裸鼠体内成瘤试验检测PCA3对前列腺癌细胞成瘤能力的影响.结果:与其他前列腺癌细胞相比,LNCaP细胞中PCA3的表达水平高,miR-194的表达水平较低;双荧光素酶试验证实PCA3可以调控miR-194的表达及活性,抑制PCA3的表达可以减弱前列腺癌细胞的增殖能力,加强其凋亡行为;过表达miR-194后前列腺癌细胞的增殖能力和凋亡行为得到一定的恢复;抑制PCA3的表达可以下调ERK信号通路的蛋白表达,抑制ERK信号通路的激活;同时过表达miR-194后可以逆转PCA3对ERK信号通路的抑制作用.抑制PCA3的表达后可以有效减弱前列腺癌细胞的体内成瘤能力.结论:PCA3可以靶向调节miR-194通过ERK信号通路调控前列腺癌细胞的增殖和凋亡行为.
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miR-194在增龄性胸腺萎缩中的表达及靶基因研究
目的:检测增龄性胸腺萎缩过程中miR-194与PTPN12的表达水平变化,并分析二者相互作用,阐明其中的分子调节机制.方法:选用C57BL/6小鼠,分为4组:1月龄组、6月龄组、10月龄组和19月龄组,每组6只,雌雄各半.麻醉后取出胸腺组织,用CD45抗体与LS柱吸附洗脱,筛选出胸腺上皮细胞.实时荧光定量PCR与Western blot方法检测随年龄增长,胸腺上皮细胞中miR-194与PTPN12基因的表达变化趋势.体外实验共转染miR-194与PTPN12荧光素酶报告载体到HEK293细胞内,分别于24、48 h后检测自发荧光值.结果:随月龄增长,miR-194表达出现下调趋势(P<0.05),而PTPN12基因表达出现上调趋势(P<0.05),且二者呈负相关性(P<0.05).体外荧光素酶报告基因结果显示,miR-194与PTPN12基因3' UTR区域发生直接作用,并在48 h结合效率高.结论:PTPN12是miR-194靶基因之一,参与了增龄性胸腺萎缩过程,是调节胸腺上皮细胞功能的重要因子.
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MiR-194靶向调节IGF-1R对胶质瘤细胞增殖和糖代谢的影响
目的 探讨miR-194对IGF-1R、IGF-1R下游信号通路表达及神经胶质瘤细胞增殖、糖代谢影响.方法 Tar-getScan预测靶向IGF-1R潜在miRNAs;双荧光素酶报告实验鉴定miR-194与IGF-1R调控作用; qPCR检测miR-194表达; Western blot检测U87细胞中蛋白表达; MTT检测细胞增殖能力;糖酵解应力试检测细胞糖代谢能力.结果 IGF-1R是miR-194的潜在靶标; miR-194能靶向调控IGF-1R表达;过表达miR-194可通过降低p-Akt表达抑制细胞增殖和葡萄糖代谢能力.结论 本研究首次证明了miR-194通过调节IGF-1R/Akt信号通路抑制胶质瘤细胞增殖和糖代谢能力,miR-194可能是治疗胶质瘤的潜在分子靶标.
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微RNA-194参与结直肠癌细胞上皮-间质转化及迁移和侵袭的作用机制探讨
目的:观察微RNA-194(microRNA-194,miR-194)在结直肠癌细胞侵袭和迁移过程中的作用,并探讨其参与细胞上皮-间质转化的作用机制.方法:将携带miR-194基因的质粒载体转染结直肠癌SW480细胞,构建稳定高表达miR-194的细胞系miR-194-480,并观察该细胞的形态学变化.采用MTT法、细胞划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别观察miR-194-480细胞的增殖、迁移和侵袭能力;同时,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测miR-194高表达对上皮-间质转化相关分子表达水平的影响.结果:高表达miR-194的结直肠癌miR-194-480细胞系构建成功,细胞由之前的扁圆形转变为梭形,发生明显的间质性改变.miR-194质粒转染后,miR-194-480细胞的增殖能力并未见明显变化(P＞0.05),但细胞迁移和侵袭能力却明显增强(P值均＜ 0.001).miR-194高表达能够上调基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和波形蛋白(vimentin)的表达水平(P＜0.05,P＜0.001),而E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达明显下调(P＜0.01).结论:miR-194通过调节MMP-2、E-cadherin和vimentin的表达,参与结直肠癌细胞的上皮-间质转化,从而明显提高结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力.
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miR-194对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响
目的:探讨microRNA-194(miR-194)对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其可能的作用机制.方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测非小细胞肺癌耐药细胞A549/DDP及其亲本细胞株A549中miR-194的表达差异,并在A549/DDP细胞中转染miR-1 94-inhibitor后检测miR-194的表达变化;应用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性、细胞增殖能力及凋亡变化;Westem blot检测转染后A549/DDP细胞中Bax和Bcl-2的表达变化.结果:miR-194在耐药细胞A549/DDP中的表达量显著高于其亲本细胞株A549 (P＜ 0.05),A549/DDP在转染miR-194-inhibitor 24 h后miR-194的表达水平较对照组显著下降(P＜0.05).抑制miR-194表达后,相对于对照组,DDP对转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P＜0.05),转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞增殖能力减弱,经DDP处理后凋亡细胞增多(P＜0.05).Western blot结果显示,与对照组相比,转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低.结论:miR-194可能通过抑制细胞凋亡,上调Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白表达而增加A549/DDP细胞对DDP的耐药性,抑制miR-194的表达可逆转A549/DDP细胞的耐药性.
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血清miR-194在结直肠癌诊断和预后判断中的价值研究
[目的]探讨血清miR-194在结直肠癌诊断和预后判断中的价值.[方法]采用实时荧光定量PCR法检测60例结直肠癌患者和60例健康志愿者血清miR-194的相对表达水平,并分析miR-194表达与结直肠癌患者预后的关系.[结果]结直肠癌患者的血清miR-194水平显著低于健康对照者(P＜0.05).按照血清miR-194相对定量值(临界值为1.015)进行结直肠癌诊断时的敏感性为70.0％,特异性为78.3％,阳性预测值为76.3％,阴性预测值为72.3％.血清miR-194可产生大受试者工作特征曲线的曲线下面积(AUC)为0.86(95％CI:0.79～0.92).N分期、cTNM分期、血清miR-194表达水平是结直肠癌患者预后的独立危险因素(P＜0.05).[结论]血清miR-194可能是一种新的非侵入性指标用于结直肠癌患者的诊断及预后判断.
