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miR-21调控PTEN/AKT通路影响LPS诱导下足细胞中MMP-2和MMP-9表达
目的 研究microRNA-21(miRNA-21,miR-21)在同源性磷酸酶张力蛋白(PTEN)及磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)信号通路中对脂多糖(LPS)刺激下足细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达的影响及调控机制.方法取传3～8代足细胞,分为LPS组和对照组,LPS组给予10 mg/L LPS,对照组给予相同剂量磷酸盐缓冲液.24 h后采用实时荧光定量PCR法和ELISA法分别检测miR-21、MMP-2及MMP-9的表达,并分析miR-21和MMP-2、MMP-9的相关性.构建外源性miR-21干扰的LPS刺激下足细胞损伤模型,采用Western blot检测外源性miR-21对MMP-2、MMP-9、PTEN和p-AKT表达的影响.结果与对照组比较,miR-21与MMP-2、MMP-9在LPS刺激下足细胞中表达升高,两者呈正相关(P<0.05).外源性上调miR-21表达,MMP-2、MMP-9和p-AKT表达升高,PTEN表达降低(P<0.05);而外源性抑制miR-21表达,MMP-2、MMP-9和p-AKT表达降低,PTEN表达升高(P<0.05).结论miR-21可通过调控PTEN/AKT通路促进LPS刺激下足细胞MMP-2和MMP-9表达.
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血管生成素2经PI3K/Akt途径对HCT-8细胞增殖的促进作用
目的:研究外源性血管生成素2(Ang-2)蛋白对结肠癌细胞株(HCT-8)中Tie-2、1-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Akt基因及蛋白表达的影响,探讨其与PI3K/Akt通路的关系.方法:用不同浓度的Ang-2蛋白(0、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0、3.0 mg·L-1)作用于HCT-8细胞,用MTT法检测细胞增殖活性,根据实验结果选定Ang-2蛋白的后续实验浓度.细胞分为正常对照组(C组)、无血清培养液组(SD组)、Ang-2组(SA2组)及LY294002组(SA2L组),应用RT-PCR及Western blotting技术分析Tie-2、PI3K、Akt基因及蛋白的变化.结果:加入不同浓度的外源性Ang-2蛋白,HCT-8细胞均有不同程度的增殖,当Ang-2的浓度为2 mg·L-1时,细胞的增殖力强.SA2组中Tie-2、PI3K及Akt 3种基因及蛋白的表达均较SD组增强(Tie-2:均P＜0.01；PI3K:P＜0.01及P＞0.05; Akt:均P＜0.01),而在SA2L组中3种基因及蛋白的表达均较SA2组减弱(Tie-2:P＜0.05及P＜0.01; PI3K:P＜0.05及P＜0.01; Akt:P＜0.01及P＜0.05).结论:Ang-2蛋白在结肠癌细胞中有促增殖作用,且其作用机制与Ang-2/Tie-2/PI3K/Akt调节的通路有关,应用LY294002可抑制该通路,实现抗肿瘤作用.
关键词： 血管生成素2 结肠癌细胞株 增殖 受体 Tie-2 1-磷脂酰肌醇3-激酶 癌基因蛋白质v-akt -
趋化因子受体CX3CR1表达沉默对人肝细胞癌Huh7细胞的作用及机制研究
目的:探讨趋化因子CX3C受体1(chemokine CX3C receptor 1,CX3CR1)对人肝细胞癌Huh7细胞的作用及其机制.方法:将靶向沉默CX3CR1表达的重组腺病毒Ad-siCX3CR1感染至人肝细胞癌Huh7细胞,然后应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测Huh7细胞中CX3CR1的表达水平,采用MTT、FCM、划痕愈合实验和Transwell小室法分别分析CX3CR1表达沉默对Huh7细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,再通过蛋白质印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)-Akt信号通路相关蛋白Akt及其磷酸化水平的变化.同时,用不同浓度的PI3K抑制剂LY294002作用感染了Ad-siCX3CR1的Huh7细胞后,分别采用蛋白质印迹法和Transwell侵袭实验检测LY294002对CX3CR1介导的Akt表达和细胞侵袭能力的影响.结果:感染Ad-siCX3CR1后,肝细胞癌Huh7细胞中CX3CR1表达被明显抑制(P＜0.001),细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显增强(均P＜0.001),凋亡能力则明显降低(P＜0.01).沉默CX3CR1表达后,Huh7细胞中Akt的磷酸化水平升高(P＜0.001),且PI3K抑制剂LY294002能有效逆转CX3CR1介导的Akt磷酸化和细胞侵袭(均P＜0.001).结论:沉默趋化因子受体CX3CR1表达可以促进人肝细胞癌Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡,其机制可能与活化PI3K-Akt信号通路有关.
关键词： 癌 肝细胞 基因沉默 受体 趋化因子CX3CL1 细胞增殖 细胞凋亡 细胞迁移分析 癌基因蛋白质v-akt -
AKT2通过调控p27表达逆转卵巢癌顺铂耐药
目的:探讨上皮性卵巢癌中蛋白激酶B beta (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2, AKT2)与p27在卵巢癌多细胞球体顺铂耐药中的作用.方法:三维培养获得人卵巢癌多细胞球体(multi-cellular spheroids, MCS); Western印迹法分析p27及AKT2表达;构建AKT2干扰载体,脂质体法转染A2780细胞后三维培养形成多细胞球体,不同浓度顺铂处理后通过FCM法检测细胞凋亡,MTT法比较细胞对顺铂的敏感性.结果:Western印迹法结果提示,MCS中AKT2及p27的表达高于单层细胞;转染AKT2干扰载体(shRNA-AKT2)的MCS中AKT2、p27表达量较未转染MCS及转染空载体的MCS明显降低.流式细胞仪分解结果表示,不同浓度顺铂作用后,MCS凋亡率明显低于单层细胞;转染shRNA-AKT2的细胞球凋亡率较未转染MCS及转染空载体的MCS升高.MTY法示瞬时转染shRNA-AKT2的细胞球顺铂对细胞抑制率较未转染MCS及转染空载体的MCS升高.结论:干扰AKT2可降低p27的表达,从而逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药.
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胃肠间质瘤p-AKT(Thr308)和p-AKT(Ser473)表达及其临床意义和预后分析
目的:探讨磷酸化蛋白激酶B(phospho-protein kinaseB,p-PKB,又称p-AKT)(Thr308)和p-AKT (Ser473)蛋白在胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)中的表达及其临床意义,并评价其在预测GIST预后方面的作用.方法:收集102例手术完整切除的原发性GIST患者肿瘤组织标本,制备组织芯片,应用免疫组织化学法检测p-AKT (Thr308)和p-AKT (Ser473)蛋白的表达水平,并将检测结果与患者的临床病理特征和无复发生存期进行统计分析.结果:GIST组织中p-AKT (Thr308)和p-AKT (Ser473)蛋白的阳性表达率分别为54.9％和56.9％,均高于相应的瘤旁组织(P＜0.05).p-AKT (Thr308)表达与GIST肿瘤大小、核分裂象计数、美国国立卫生研究所(National Institute of Health,NIH)危险分级和5年无复发生存率均有相关性(P＜0.05),而p-AKT(Ser473)表达与GIST原发部位、肿瘤大小、核分裂象计数、肿瘤细胞密度、肿瘤性坏死、NIH风险分级和5年无复发生存率相关(P＜0.05).单因素及多因素生存分析显示,p-AKT (Thr308)和p-AKT (Ser473)两者均阳性表达的患者,其5年无复发生存率低于二者均阴性表达的患者(P＜0.05).结论:完全活化的AKT蛋白表达可能与GIST的发生、发展以及不良预后有关.联合检测p-AKT (Thr308)和p-AKT (Ser473)蛋白表达水平有助于预测GIST的预后.
关键词： 胃肠道间质肿瘤 组织阵列分析 免疫组织化学 癌基因蛋白质v-akt 预后 -
京尼平苷通过PI3K-Akt途径拮抗黑素细胞氧化损伤
目的 探讨京尼平苷对体外培养的人黑素细胞氧化损伤的拮抗作用,以及PI3K-Akt途径在其中的作用.方法 取健康青少年环切术后包皮,分离并培养表皮黑素细胞.取第2～3代黑素细胞,分为对照组(不做任何处理)、京尼平苷组(125 μmol/L京尼平苷处理)、LY294002组(5μmol/LLY294002处理)、H2O2组(250 μmol/LH2O2处理)、京尼平苷+H2O2组(125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入250 μmol/L H2O2作用4h)、京尼平苷+LY294002+H2O2组(125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入5 μmol/L LY294002作用1h,然后用250 μmol/LH2O2作用4h).作用完成后,用噻唑蓝(MTT)法检测黑素细胞增殖活性,Western印迹检测Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、血红素加氧酶1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx-1)蛋白的表达,生物化学方法检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)含量.通过单因素方差分析(ANOVA)对各组间数据进行比较,采用SNK-q检验进行组间两两比较.结果 H2O2组细胞增殖率较对照组明显降低(P＜0.01),p-Akt(P＜ 0.01)、HO-1 (P＜ 0.01)、GPx-1(P＜ 0.05)蛋白表达水平下降,SOD活性、CAT活性降低(均P＜ 0.01),ROS含量显著升高(P＜0.01).与H2O2组相比,京尼平苷+H2O2组黑素细胞增殖率上升(72.98％±8.92％比50.53％±10.85％,P＜ 0.05),p-Akt(P＜ 0.05)、HO-1 (P＜ 0.01)、GPx-1 (P＜ 0.01)蛋白表达上调,SOD[(6.82±1.03) U/mg比(1.29±0.43) U/mg,P＜0.05]和CAT[(46.08±4.16) U/mg比(18.71±3.09) U/mg,P＜0.05]酶活性增高,ROS含量(1 284.33±110.64比2 158±222.75,P＜0.01)减少;京尼平苷+ LY294002+H2O2组黑素细胞增殖率(44.35％±14.85％)较京尼平苷+H2O2组降低(P＜0.05),p-Akt(P＜ 0.01)、HO-1(P＜ 0.05)、GPx-1(P＜ 0.01)蛋白表达下调,SOD活性[(1.31±0.65) U/mg,P＜0.05]和CAT活性[(23.25±5.56) U/mg,P＜0.05]减弱,ROS含量增加(1 668±62.03,P＜ 0.05).结论 京尼平苷可通过PI3K-Akt途径促进黑素细胞HO-1和GPx-1表达,增强SOD和CAT活性,拮抗黑素细胞氧化应激损伤.
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ERCC1和AKT2在胃癌组织中的表达及其临床意义
【目的】探讨切除修复交叉互补基因1（ERCC1）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）两种蛋白在胃癌组织中表达情况及其意义。【方法】采用 SP免疫组织化学法检测76例胃癌组织中 ERCC1、AKT2蛋白的表达情况，并与42例正常胃黏膜组织进行比较。【结果】胃癌组织中 ERCC1、AKT2蛋白表达定位于细胞核和浆， ERCC1表达明显低于正常胃黏膜组织，而 AKT2阳性表达明显高于正常胃黏膜组织（P ＜0．05）。ERCC1和AKT2蛋白的表达与淋巴结转移及病理分期有关（P＜0．05），两者之间表达呈无明显相关性。术后化疗患者中ERCC1和 AKT2阴性者预后好于均阳性者。【结论】ERCC1和 AKT2在与胃癌预后及耐药密切相关，对其变化进行检测可帮助了解胃癌患者的肿瘤恶性程度，指导制定个体化治疗方案并判断预后。
关键词： 胃肿瘤/病理学 癌基因蛋白质v-akt 肿瘤蛋白质类
