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碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活
目的 建立碱滴定法测定发酵液中青霉素酰化酶酶活的方法.方法 以青霉素为反应底物,温度25℃,pH值维持在7.8, 采用电位滴定仪滴定氢氧化钠溶液,中和生成的苯乙酸,计算出单位时间内青霉素的减少量,进而计算出酶活.结果 酶活在20～100 IU范围内线性良好,相关系数0.999,重现性好,RSD为2.773%.结论 碱液滴定检测发酵液中青霉素酰化酶酶活简便、准确.
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pNPG法测定纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶
以对硝基酚-β-葡萄糖苷(pNPG)为底物测定纤维素酶活力,目前,没有一个统一的标准,很难比较文献中的酶活力大小.本文通过试验,以期探讨一个共同的标准.
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南极海泥沉积物放线菌的筛选及其酶活抑菌特性考察
极地海泥沉积物为放线菌的新来源,放线菌的次级代谢产物因具有抗菌、抗肿瘤、生物酶等特性得到广泛重视.为了发现具有潜在新活性的放线菌,本实验中对南极海泥来源的两份样品,利用2种方法(土壤稀释,分散差速离心法),5种分离培养基进行放线菌的筛选.对经过初步排重后得到的放线菌扩增其16srDNA后进行序列分析从而判断属别.利用多种鉴定培养基以及平板涂布法,对胞外酶表达情况及抗菌能力进行考察.结果显示此次5种放线菌分别隶属微球菌、小单胞菌、链霉菌属,进化树分析其分别与以下菌株为同源:Micrococcus yunnanensisi YIM 65004T(96.29％),Micromonospora chalcea DSM 43026T(99.66％),Streptomyces rutgersensis NBRC 12819T(99.99％),Streptomyces rutgersensis NBRC 12819T(99.66％),and Streptomyces griseorubens NBRC 12780T(99.93％).虽在抗菌实验中,只有一株放线菌表现出只抗Enterococcus avium活性,但对酶活研究中显示菌株XE-1、XP可高产蛋白酶、X-38可高产酯酶、X7可高产脲酶及酪氨酸酶,此外XE-1还具有几丁质酶活性,都具开发潜力.所以此次分离得到的放线菌可以作为潜在的新型生物酶来源进一步研究.
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培养条件对重组青霉素G酰化酶表达及后翻译的影响
青霉素G酰化酶(PGA)具有良好的催化酰化/去酰化特性,广泛应用于半合成及β-内酰胺抗生素工业中.由于嗜柠檬酸克鲁沃尔氏菌(Kc)产生的PGA具有良好的适于工业应用的特性,因此,对Kc来源的PGA在重组菌BL21(DE3)中的表达进行产酶条件优化.通过调整培养基装量、培养温度、起始pH值及诱导剂的浓度,结合对细胞生长量、蛋白表达量及酶活高低的检测,以期得到产生活性PGA的优条件.发现起始pH值为7.0,装量30 mL,30℃培养,1.0 mmol/L IPTG诱导6h时,菌浓为16.83,总酶活达到27 905 U/L,单位酶活1 658 U/L/OD600的佳结果.通过分析培养条件对PGA蛋白表达量(SDS聚丙烯凝胶电泳)和酶活的影响,发现PGA前体表达后的后翻译过程是产生活性酶的关键因素,该结果将为后期研究和工业应用提供重要参考依据.
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重组大肠杆菌高效催化肌醇合成葡萄糖醛酸的研究
葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域都有广泛的应用.该研究利用重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX)催化肌醇生成葡萄糖醛酸.首先对重组大肠杆菌培养条件进行优化以达到肌醇氧化酶高效表达的目标,以MBL作为发酵培养基,在对数生长期中期(OD600=5.5)加入0.1 mmol/L IPTG,27℃下诱导6h,肌醇氧化酶的酶活达到100.5 kU/L.然后利用重组菌菌体作为催化剂转化肌醇生产葡萄糖醛酸,以2 g/L肌醇为底物,30℃下反应2h,葡萄糖醛酸的产量达到1.7g/L,肌醇的转化率为84％.在此基础上,进一步考察了多次添加新鲜菌体对葡萄糖醛酸合成的影响,当肌醇浓度为50 g/L时,经过3次添加菌体葡萄糖醛酸的终产量达到15.7 g/L.该研究为生物法生产葡萄糖醛酸打下了坚实的基础.
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一种新型PAK1抑制剂诱导结直肠癌DLD-1细胞凋亡的机制研究
PAK1蛋白激酶在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,筛选开发新的PAK1抑制剂作为肿瘤治疗靶向药物具有重要意义.传统的PAK1抑制剂筛选方法存在成本高、效率低等缺陷,而计算机虚拟筛选可降低发现活性先导化合物的成本,提高筛选效率.本实验采用计算机辅助药物虚拟筛选结合Z'lyteTM高通量激酶筛选出1种PAK1靶向候选化合物,体外酶活性检测发现化合物18(K788)具有良好的PAK1抑制活性(抑制率为42.7％).进一步通过MTT检测发现K788具有显著的PAK1阳性肿瘤杀伤活性,抑制活性优于阳性药IPA-3(inhibitor of p21-activated kinase compound-3).采用流式细胞分析、Western blot检测发现K788能通过抑制PAK1的表达及其活化以激活caspase凋亡通路,诱导结肠癌细胞DLD-1的凋亡.K788具有临床开发应用的潜力,可作为PAK1靶向先导分子进行深入研究.
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肿瘤耐药性相关的MGMT分析方法
O6-甲基鸟嘌呤- DNA基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene,MGMT)活性是衡量肿瘤细胞耐药性的重要因子.多种方法被用于MGMT分析,文章概述现已报道过临床上常用的多种从蛋白质水平、核酸水平以及酶活三方面检测肿瘤中MGMT的方法.几种方法都存在不足之处,都处于实验研究阶段,仍不能广泛用于临床检测.快速适用的MGMT临床检测方法,有待于研究.
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微生物酶基因克隆与表达的初步尝试
目的 探索微生物酶基因的克隆与表达,为新药的开发和利用寻找新途径.方法 以黑曲霉M-1菌株总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,将扩增后的α-葡萄糖转苷酶CDNA重组到载体pSE380中构建重组质粒pSE-atg,并由其将此酶基因导入大肠杆菌BL21(DE7),通过IPTG诱导剂诱导表达目的蛋白.结果 黑曲霉M-1菌株总RNA适合作反转录PCR的模板；目标酶cDNA己正确连接到pSE380质粒上、并通过此质粒转移至大肠杆菌BL21(DE7)成功实现重组,且在重组大肠杆菌上的酶基因表达无误.结论 α-葡萄糖苷酶基因能被成功克隆与表达,这为新药的开发和利用开僻了一条新思路.
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2709碱性蛋白酶酶活测定的影响因素研究
目的：研究福林法测定蛋白酶酶活时的影响因素。方法测定2709碱性蛋白酶酶活，对比分析了各种常见差异造成的影响。结果酪蛋白、滤纸的选择及样品稀释液配制时间对酶活测定影响较大，福林试剂、样品溶解方式等影响不明显，而酶活计算方法的不同也会带来差异。结论检测人员在检测前应明确采用的方法、试剂及计算方法。
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动脉粥状硬化与血清中磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性的相关性研究
炎症在动脉粥状硬化(AS)形成过程中起关键作用,PC-PLC 在炎症反应中扮演重要角色.为探讨 PC-PLC 活性与动脉粥样硬化的关系,本研究建立了动脉粥状硬化家兔模型,并用解毒活血颗粒灌胃,分别获得正常家兔血清、造模家兔血清和药物家兔血清,检测其中 PC-PLC 的活性.结果表明,造模组中钙离子依赖性和非钙离子依赖性两种 PC-PLC 活性均明显高于正常组,而加药组中这两种 PC-PLC活性受到显著抑制.说明伴随动脉粥样硬化的发生,PC-PLC 活性明显升高,而活血解毒颗粒能减轻动脉粥样硬化的程度,同时能显著抑制 PC-PLC 活性.
关键词： 炎症 动脉粥状硬化 血清 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C 酶活 -
洋葱中蒜氨酸酶的提取分离及酶活力测定
目的 优选洋葱中蒜氨酸酶的提取工艺,并测定酶活力.方法 首先建立了三波长分光光度法测定蒜氨酸酶活力,然后以新疆洋葱为原料,采用硫酸铵盐析法、PEG8000沉淀法和PEG6000沉淀法分别对蒜氨酸酶进行提取分离,同时还考察了蒜氨酸酶底物-蒜氨酸的提取方法.结果 三波长分光光度法的检测波长为λ1=426nm、λ2 =446 nm、λ3=506nm；回归方程ΔA=0.91263C+0.00698,相关系数r=0.9998；方法回收率为99.2％～108.4％,RSD为2.41％.硫酸铵盐析法、PEG8000沉淀法和PEG6000沉淀法沉淀蒜氨酸酶的佳饱和度分别是45％,20％,20％；佳料液比1:1,佳打浆时间2 min,而蒜氨酸酶的佳提取方法是20％ PEG8000沉淀法；底物蒜氨酸的佳提取方法是微波灭酶法.结论 研究结果为今后蒜氨酸酶提取工艺的进一步优化提供了指导.
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鲜天麻保存中相关生理特性的研究
目的:研究鲜天麻保存中相关生理特性的变化规律,为天麻的留种保存及保鲜方法的摸索提供理论基础.方法:采收红天麻后,每5d测定鲜天麻在保存中淀粉酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、果胶酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等酶活的变化规律及相应含水量、硬度、呼吸强度等生理指标.结果:随着时间的推移,绝大部分酶的活性均是先升后降,呈抛物线趋势,但蛋白酶、磷酸酶的酶活是一直在上升,不同酶及同一酶不同时期的酶活也有较大的差异;含水量、呼吸强度均是先降后升,硬度却是先升后降.结论:鲜天麻保存中可能先消耗体内淀粉等糖类物质,然后再消耗蛋白、脂类等;氧化保护酶类约在10 d后显著上升,20 d后开始下降;呼吸强度与含水量呈显著性正相关;硬度与过氧化物酶、多酚氧化酶呈显著性中度正相关等.
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唾液淀粉酶活性影响因素教学实验改进探讨
唾液淀粉酶活性影响因素的探讨是现行大中专院校生物化学实验中的常见项目。然而由于不同人群中唾液淀粉酶的活性相差较大，从而导致酶量很难控制。此外现行实验教材中该实验设计粗放，导致实验结果与现行生物化学理论不一致。因而本文从酶含量的确定、温度、pH值、激活剂与抑制剂几个方面，对该实验设计提出建议。
