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呋喃丹对大鼠睾丸组织标志酶活性影响的动态观察
为探讨农药呋喃丹对雄性大鼠睾丸组织的损害作用,以低、中、高剂量(0.3、1.5和3.0mg/kg BW)经口连续染毒77天,分别于染毒第7、35和77天检测大鼠血清及睾丸组织匀浆中β-葡萄糖苷酶(β-G)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)、乳酸脱氢酶同工酶X(LDHx、)的活性.结果显示,染毒第7天大鼠3个染毒组血清中β-G活性显著低于对照组(P<0 .05),低剂量组睾丸组织匀浆中β-G活性高于对照组、而高剂量组低于对照组(P<0.05);染毒第77天中高剂量组血清中G-6-PD活性,高剂量组睾丸组织匀浆中LDHx活性均低于对照组(P<0.05),其它指标及时段未见明显改变.提示呋喃丹对大鼠睾丸组织有一定损害作用.
关键词： 呋喃丹 β-葡萄糖苷酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 乳酸脱氢酶同工酶 -
知母皂苷AⅢ酶解工艺优选
目的:优选知母皂苷AⅢ的酶解工艺.方法:采用β-葡萄糖苷酶水解知母皂苷制备知母皂苷AⅢ,以知母皂苷AⅢ转化率为指标,通过单因素和正交试验考察反应温度、反应时间、pH及酶用量对知母皂苷AⅢ酶解工艺的影响.结果:佳酶解工艺条件为温度55℃,pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液,酶用量600 U·g-1,反应时间3h.结论:优选的酶解工艺简单可靠,反应条件温和,适用于工业化生产.
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人参皂苷生物转化研究进展
人参皂苷是人参属植物药理活性的重要物质,尤以稀有人参皂苷及苷元的抗肿瘤,保护神经系统,保肝护肝等药理活性为显著,因此,研究稀有人参皂苷获取的方法也日益增多.该文对人参属植物中人参皂苷的生物转化进行了简要的概述和展望.
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玄参中β-葡萄糖苷酶活性测定条件及干燥过程中酶活性变化的研究
采用pNPG法测定玄参中β-葡萄糖苷酶的活性,通过单因素及均匀设计实验对提取液的种类、反应体系、反应时间、温度、以及底物浓度等提取条件与反应条件进行了筛选,并在此基础上测定了新鲜玄参在40 ～100℃干燥温度中酶活性的变化.结果显示,柠檬酸磷酸缓冲液提取效果较好,50℃环境下反应30 min时酶促反应产生的吸光度大,均匀设计实验确定佳提取液pH7.0、酶反应体系pH6.0、底物浓度20 mmol·L-1.酶活性变化受干燥温度和失水率影响,60～100℃干燥过程中温度升高,随着失水率加快酶活性迅速下降,而40,50℃干燥过程中一定的酶活性始终存在.该研究为环烯醚萜苷类水解机制和佳干燥工艺的研究奠定了理论基础.
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利用一种耐热耐糖β-葡萄糖苷酶制备黄芩素的研究
对利用一种耐热耐糖β-葡萄糖苷酶水解黄芩苷制备黄芩素进行了研究.该酶催化黄芩苷转化为黄芩素的反应能在醋酸-醋酸钠缓冲液中良好地进行,酶的适pH5.5,适反应温度85 ℃,温度在85℃以下,pH 5 ～7.5酶的稳定性良好.酶的大反应速率Vmax为0.41 mmol·L-1·min-1,米氏常数Km为3.31 mmol·L-1.不同的金属离子对酶的活性有不同的影响,醋酸-醋酸钠缓冲液中的Na+对酶有活化作用.反应体系中葡萄糖醛酸浓度低于0.6 mol·L-1时,对酶有活化作用,当单糖浓度大于0.6 mol·L-1时,对酶有抑制作用,当单糖浓度达到1.2 mol· L-1时,酶活抑制率为50％,糖耐受性较好.通过实验得出较佳反应条件为黄芩苷-酶液1 g∶0.2 mL,pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液,反应时间为10 h时,反应温度为85℃,酶解率可达97％.
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D-纤维二糖对龙胆苦苷口服吸收的影响
该实验研究了D-纤维二糖对龙胆苦苷口服吸收的影响.初步考察了不同用量的D-纤维二糖在β-葡萄糖苷酶或大鼠肠道菌作用下对龙胆苦苷的降解程度,发现D-纤维二糖能够抑制龙胆苦苷肠道降解;在口服生物利用度实验中,在高比例条件下(龙胆苦苷-D-纤维二糖1∶5,1∶10),D-纤维二糖能够显著提高龙胆苦苷的口服生物利用度(p＜0.05),推测可能是D-纤维二糖竞争性结合肠道中的β-葡萄糖苷酶,延缓了龙胆苦苷的降解,从而提高口服生物利用度.
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3种嗜热β-葡萄糖苷酶催化黄芩苷生产黄芩素的研究
该文分析了来自嗜热菌Thermotoga thermarum DSM 5069的Ttebgl3和Thermotoga petrophila RKU-1的Tpebgl1,Tpeb-gl3等3种β-葡萄糖苷酶基因及其序列,比较了3种β-葡萄糖苷酶催化转化黄芩苷的适温度、pH以及DMSO、金属离子对催化转化黄芩苷的影响,并比较了3种β-葡萄糖苷酶转化黄芩苷的动力学常数.结果表明,Tpebgl1,Tpebgl3,Ttebgl3转化黄芩苷的适pH分别为4. 5,5. 0,5. 5,适温度为85,80,80 ℃.Tpebgl3酶和Ttebgl3酶催化转化黄芩苷时对DMSO的耐受性较好.金属离子对3种β-葡萄糖苷酶催化转化黄芩苷的激活作用不明显,GH3家族β-葡萄糖苷酶受到的抑制作用明显强于GH1家族.3种β-葡萄糖苷酶催化黄芩苷的动力学常数存在较大差异,Tpebgl1,Tpebgl3,Ttebgl3酶的Km分别为0. 029 2,0. 268 6, 0. 391 8 mmol·L-1,Vmax分别为4. 85,121. 04,308. 90 U·mg-1.Tpebg1,Tpebgl3,Ttebgl3酶分别在其适pH,温度下转化0. 02 g黄芩苷,3 h后转化率分别达到68％,97. 3％,97. 31％,且GH3家族的酶用量少、催化效率高.研究结果为高效酶的获得及规模化生物制备黄芩素提供了技术支撑.
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β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷诱导LoVo细胞凋亡及活性对Bax与bcl-2基因表达和Caspase-3的影响
目的:观察苦杏仁苷被β-葡萄糖苷酶特异激活后对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响.方法:分别将不同浓度的苦杏仁苷加β-葡萄糖苷酶作用于大肠癌LoVo细胞株24 h,通过细胞形态学、DNA凝胶电泳、流式细胞仪观察细胞凋亡变化,RT-PCR方法检测细胞bcl-2、Bax mR-NA表达变化,Caspase-3试剂盒检测细胞Caspase-3酶活性的变化.结果:0.1～1.0mmol/L的苦杏仁苷与250 nmol/L的β-葡萄糖苷酶作用于细胞24 h后,可见到以凋亡为主的形态变化:细胞核固缩、染色质凝集及核碎裂、染色质片段化,琼脂糖凝胶电泳见DNA断裂成有规律的特征性梯状条带,流式细胞仪分析显示在G1期细胞前出现亚二倍体峰;RT-PCR检测显示Bax mRNA表达升高,而bcl-2 mRNA表达无变化Caspase-3酶活性呈剂量依赖性增加.结论:苦杏仁苷被β-葡萄糖苷酶特异性激活后能导致LoVo细胞凋亡,这一过程中,Bax基因表达上调及Caspase-3酶活性增加与LoVo细胞凋亡有关.
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染料木素与β-葡萄糖苷酶相互作用的研究
本文研究了染料木素与β-葡萄糖苷酶的相互作用.采用荧光光谱法研究了染料木素与β-葡萄糖苷酶的结合反应,二者的相互作用使β-葡萄糖苷酶发生内源荧光猝灭,属于静态猝灭机制.通过计算得到染料木素与β-葡萄糖苷酶在17、27和37℃下的结合常数分别为3.69×104、3.06 × 104和2.36×104 L·mol-1.同步荧光研究了染料木素对β-葡萄糖苷酶结构的影响,染料木素可使β-葡萄糖苷酶的构象发生变化、色氨酸残基所处微环境的疏水性降低.染料木素对酶活性的抑制试验结果表明其对酶的活性具有明显的抑制作用,双分子结合速率常数为1.2×103(mol·L-1)·min-1.结合AutoDock 4.2分子对接软件模拟研究了二者的键合模式和键合机制,表明氢键和疏水作用对染料木素与β-葡萄糖苷酶的结合起重要作用,同时还存在静电作用.
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淫羊藿苷仿生酶解过程的多因素考察
本实验对影响淫羊藿苷仿生酶解成宝藿苷Ⅰ的多种因素进行考察,并选择佳反应条件,为构建新型的淫羊藿苷仿生酶解给药系统提供研究基础.以酶解温度为37℃、缓冲溶液为人工肠液和人工胃液模拟体内环境,并以宝藿苷Ⅰ转化率为指标,考察酶的种类、酶活力、水解底物浓度、反应时间、人工肠液中胰酶及表面活性剂对宝藿苷Ⅰ生成的影响.结果表明:在人工胃液中纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和蜗牛酶均失活,基本没有宝藿苷Ⅰ生成;人工肠液中胰酶对β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶酶解反应没有明显影响(P＞0.05),但显著降低纤维素酶的活性(P＜0.05).人工肠液中β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷得到的宝藿苷Ⅰ多,佳反应条件为酶活力10 U·mL-1、底物浓度1 mg·mL-1和3 g·L-1鼠李糖脂,反应时间3h,此条件下宝藿苷Ⅰ转化率达99.8％.
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人参皂苷Rg3及人参皂苷Rh2在肠道菌群失调大鼠体内的药动学研究
目的 研究人参皂苷Rg3及其脱糖基代谢物人参皂苷Rh2在林可霉素诱导的肠道菌群失调大鼠体内的药动学特征.方法 建立同时测定大鼠血浆中人参皂苷Rg3及人参皂苷Rh2的LC-MS/MS分析方法,并进行专属性、线性、回收率、准确度、精密度的考察.采用ig林可霉素诱导菌群失调大鼠模型,测定正常大鼠及模型大鼠粪便含水量及β-葡萄糖苷酶活性.正常大鼠及肠道菌群失调大鼠分别ig给予人参皂苷Rg3(20 mg/kg),于不同时间点眼眶取血测定血药浓度.结果 与对照组比较,模型组大鼠粪便含水量显著增加(P＜0.01),β-葡萄糖苷酶活性显著降低(P＜0.01);大鼠血浆中人参皂苷Rg3的Cmax、AUC0-∞值均有所升高,但不具有显著性差异;而其活性代谢物人参皂苷Rh2的Cmax,AUC0-t值与对照组相比显著降低(P＜0.01).结论 肠道菌群失调对人参皂苷Rg3的药动学行为影响较小,但显著改变了其活性代谢物人参皂苷Rh2的药动学,可能与菌群失调后导致大鼠肠道菌大幅下降进而影响了人参皂苷Rg3的肠道脱糖代谢有关.
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黑曲霉转化牛蒡子水提液中牛蒡子苷的研究
目的 采用黑曲霉Aspergillus niger ZJUT302产生的β-葡萄糖苷酶水解牛蒡子水提液中的牛蒡子苷,提高牛蒡了苷元的量.方法 A.niger ZJUT302在培养基成分为稻草粉50g/L、麦麸15g/L、大麦粉15 g/L、(NH4)2SO4 10 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L,温度30℃,初始pH 5.0,添加0.1%聚乙二醇5000,摇床转速150 r/min的优化反应条件下转化牛蒡子水提液7 d.结果 牛蒡子苷在初始浓度0.06 mmol/L时,转化率可达92.3%.结论 本方法是一种有效的牛蒡子生物炮制技术.
关键词： 牛蒡子苷 牛蒡子苷元 黑曲霉ZJUT302 β-葡萄糖苷酶 生物转化技术 -
西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物的制备及鉴定
目的：制备西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物并鉴定其酶活性与抗体活性。方法采用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)将西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶进行共价交联。采用非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、比色法、间接免疫荧光法对偶联物进行鉴定并检测β-葡萄糖苷酶、西妥昔单抗的活性。结果在电泳图上可分别见到β葡萄糖苷酶、西妥昔单抗、西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物的清晰条带。比色法测定结果显示，西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L：672.97±46.19 vs 869.50±57.28，t=5.972，P<0.05)，但仍保持良好的酶活性。在荧光显微镜下可见到与偶联物共同作用的人膀胱癌EJ细胞带有红色荧光。结论 Sulfo-SMCC可成功将西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶偶联，且偶联物仍能保持良好的酶活性与抗体活性。
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蜗牛酶中一种β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究
通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出1种具有人参皂苷Rb_1水解活性的β-葡萄糖苷酶.纯化后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带.反应适pH为5.6,适温度是80 ℃.pH稳定范围很广,在pH为4.0～11.0的溶液中和温度60 ℃以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶.Na~+、K~+、Li~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、EDTA、DTT和SDS不影响该酶活性,而Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)对该酶则具有明显的抑制作用.pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189 μmol/(min·mg).
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异丙基-1-硫-β-D-吡喃型葡萄糖苷的合成
介绍了黑曲霉菌β-葡萄糖苷酶诱导剂异丙基-1-硫-β-D-吡喃型葡萄糖苷(1)的合成路线。以葡萄糖为起始原料，合成β-D-1,2,3,4,6-五-O-乙酰基吡喃葡萄糖(2)，再与2-丙硫醇作用得到异丙基-2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-硫-β-D-吡喃型葡萄糖苷(3)，再经醇解得到1。
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血清β-葡萄糖苷酶在新生儿坏死性小肠结肠炎中的诊断价值
目的:研究血清中β-葡萄糖苷酶(CBG)和C反应蛋白(CRP)在早期诊断新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)的应用价值.方法:收集47例通过临床症状和腹部X线确诊为NEC的新生儿作为病例组,47例同期因其他疾病入院的新生儿为对照组,监测患者的CRP浓度,并应用ELISA法检测两组患儿的血清CBG,分析CBG和CRP与新生儿NEC的相关性.结果:①CGB和CRP在NEC患儿体内显著高于非NEC对照组(P＜0.01),非NEC患者中CGB的含量更稳定.②随着病理分期的严重程度,CGB和CRP的阳性检出率逐渐递增,CBG对于早期诊断NEC具有更高的特异性.③随着病变程度的加重,CBG和CRP的含量明显升高,且两者之间呈正相关.结论:血清CBG在NEC早期即增高,且与NEC的病变分期有更强的相关性,敏感度和特异性高于CRP,可作为NEC早期诊断和判断病变程度的重要指标.
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嗜热β-葡萄糖苷酶的原核表达、纯化及其活性
目的 原核表达、纯化嗜热β-葡萄糖苷酶,并检测其活性.方法 从嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans基因组DNA中PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3) CodonPlus,筛选阳性重组菌,IPTG诱导表达.采用镍柱亲和层析法纯化重组酶;紫外吸收法检测酶活力和底物选择性.结果 PCR退火温度为67℃时,可扩增得到单一的目的基因条带;测序结果显示,重组表达质粒中目的基因的核苷酸序列与细菌基因组中该基因序列同源性为100％,未发现终止密码子及氨基酸的改变;表达的重组酶相对分子质量约为54 000;纯化的目的蛋白纯度达95％,浓度为10 mg/L;该重组酶能够高效催化对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)的水解,60℃条件下的比活力达124 293.5 U/mg.结论 成功在E.coli中表达了嗜热细菌Fe rvidobacterium pennivorans来源的具有较高催化活力和底物专一性的β-葡萄糖苷酶.
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植物源β-葡萄糖苷酶活性检测方法学研究
目的:来源于植物β-葡萄糖苷酶活性检测的方法学研究.方法:以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物,β-葡萄糖苷酶为催化剂催化底物生成对硝基苯酚,用紫外分光光度法测定对硝基苯酚的含量,根据生成的对硝基苯酚含量计算酶活性,并对此进行方法学研究.结果:对硝基苯酚标准曲线的相关系数为0.999;催化反应的线性相关系数为0.999;反应精密度的相对标准偏差为0.05％;方法重复性的相对标准偏差为2.8％;方法耐用性考察中,酶活性均大于1200 U/g,九个不同方法参数的酶活性相对标准偏差为4.6％;中间精密度实验中,十二份样品酶活性的相对标准偏差为6.6％;稳定性实验中,β-葡萄糖苷酶与底物反应后,放置0小时、16小时、22小时后,测定的酶活性均大于1200 U/g,相对标准偏差为1.1％.结论:此方法线性较好,有良好的方法重复性、精密度、中间精密度、耐用性和溶液稳定性,适用于来源于植物的β-葡萄糖苷酶活性检测.
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pNPG法测定纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶
以对硝基酚-β-葡萄糖苷(pNPG)为底物测定纤维素酶活力,目前,没有一个统一的标准,很难比较文献中的酶活力大小.本文通过试验,以期探讨一个共同的标准.
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青黛炮制工艺中浸泡原理研究
目的:阐明青黛传统炮制加工过程中浸泡的原理.方法:采用高效液相色谱法对马蓝茎叶浸泡过程中吲哚苷释放过程进行研究.吲哚苷检测波长为280 nm,流动相为甲醇-水(15:85).结果:吲哚苷在0.374～3.74 μg范围内呈良好线性关系(r=0.999 9);马蓝茎叶浸泡液中吲哚苷含量呈现先升后降趋势,在0～10 h呈现上升趋势,并且在10 h达到大含量34.01 mg,在10～16 h呈现下降趋势,在16 h减少为0;对吲哚苷在水溶液中稳定性考察,吲哚苷相对百分含量随着时间延长基本不变,在2 h时为99.96%,到16 h时降低为99.11%,多减少0.89%;对β-葡萄糖苷酶催化吲哚苷水解研究,吲哚苷相对百分含量随着时间延长快速降低,到60 min时降低为0.结论:马蓝茎叶的浸泡原理是吲哚苷从马蓝茎叶中释放出来溶解于水中同时伴随β-葡萄糖苷酶催化水解.
