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家蝇Ⅲ龄幼虫消化系统内源性β-葡萄糖苷酶的组织定位和表达差异研究
目的 以家蝇Ⅲ龄幼虫为研究对象,探讨家蝇(Musca domestica)消化系统内源性β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)的组织分布、表达差异和器官功能定位. 方法 用原位杂交鉴定家蝇β-葡萄糖苷酶mRNA的组织定位.免疫组织化学法鉴定纤维素酶的组织定位.分离家蝇Ⅲ龄幼虫消化系统组织,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定β-葡萄糖苷酶的活性,实时荧光定量PCR法检测家蝇β-葡萄糖苷酶mRNA在消化系统各器官中的表达差异. 结果 原位杂交显示,中肠、前肠和唾液腺上皮细胞是家蝇β-葡萄糖苷酶mRNA表达的部位.免疫组织化学染色显示,唾液腺、前肠和中肠上皮细胞是家蝇幼虫产生和分泌纤维素酶的主要部位.DNS法测定结果显示,家蝇幼虫唾液腺、前肠、中肠和后肠的β-葡萄糖苷酶活性分别为(0.80±0.06)、(0.38±0.02)、(1.20±0.05)和(0.26±0.02) IU/mg,各部位间酶活性差异有统计意义(P＜0.05)；中肠的酶活性较高,占总酶活性的(45.45±1.27)％,后肠的酶活性低,为(9.85±0.88)％.实时荧光定量PCR显示,家蝇β-葡萄糖苷酶mRNA只在前肠、中肠和唾液腺中表达,中肠的表达量约为前肠的5倍,唾液腺的表达量约为前肠的3倍,3者表达量差异有统计学意义(P＜0.05),而后肠未见该基因的表达.结论 家蝇Ⅲ龄幼虫前肠、中肠和唾液腺均能分泌内源性β-葡萄糖苷酶,唾液腺和中肠为主要分泌器官.
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黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的纯化及对中药糖苷类成分的转化
为探讨黑曲霉B2所产β-葡萄糖苷酶对几种中药糖苷类化合物的转化能力,本研究通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex离子交换色谱等方法对黑曲霉B2所产β-葡萄糖苷酶进行了初步分离纯化,并以TLC法检测其酶解产物.结果表明,黑曲霉B2所产β-葡萄糖苷酶可在30 min内将各种中药糖苷类底物完全转化为相应苷元.表明该酶能够高效水解不同的中药糖苷类底物,具有较好的应用潜力.
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β-葡萄糖苷酶水解栀子苷的工艺研究
目的:研究栀子苷元佳制备工艺.方法:采用β-葡萄糖苷酶水解的方法将栀子苷转化为苷元,以栀子苷元转化率为指标,正交试验优化β-葡萄糖苷酶水解栀予苷的工艺.结果:佳水解条件为:水解介质pH4.5、反应温度50℃、酶用量9600U·ml-1,水解时间1h,栀子苷元转化率为44.7%,纯度为97.3%.结论:选取的水解工艺条件合理、可行,栀子苷元转化率高.
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β-葡萄糖苷酶水解牛蒡子苷制备牛蒡子苷元
采用β-葡萄糖苷酶水解牛蒡子苷制备牛蒡子苷元.产率和反应初速度随β-葡萄糖苷酶用量的增多而提高.佳水解反应条件为35℃,pH5.0,40 h.产率随着牛蒡子苷初始浓度的提高而降低.在佳反应条件下,β-葡萄糖苷酶水解牛蒡子苷的过程符合单底物Michaelis Menten方程,v＝VmC8/Km+C8,其中:Vm＝2.5×10-2mmol/L·h,Km＝3.8×10-1mmol/L.
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一种β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定
目的:克隆扣囊复膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶基因 (BGL1),为β-葡萄糖苷酶基因的表达作准备.方法:用PCR方法从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因连接到pGEM-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K.再将β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中进行克隆,并进行鉴定.结果:重组pPIC9K转化大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母后,进行酶切和PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆.结论:应用大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了β-葡萄糖苷酶基因.
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黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
目的 构建糖类标记载体筛选克隆.方法 以pPIC9K-βG12为模板,通过PCR扩增得到全长的Bgl2基因片段,克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21(DE3),cel-M9培养基筛选阳性克隆,经DNA测序分析,成功构建pET28a-Bgl2表达载体.SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的 蛋白,其相对分子质量与预期结果 相符.结果 PCR扩增得到Bgl2基因片段,SDS-PAGE显示蛋白以包涵体形式表达,克隆可用Cel-M9培养基筛选.结论 用Cel-M9培养基筛选出阳性克隆为构建食品级载体奠定基础.
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里氏木霉β-葡萄糖苷酶的研究进展
本文系统介绍里氏木霉β-葡萄糖苷酶的概况、酶学特性、结构、催化机理,以及近年国内外的应用现状和研究前景.
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穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物的制备及活性鉴定
目的 制备穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物并鉴定其穿膜活性和酶活性.方法 采用异型双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)将穿膜肽·增强型绿色荧光蛋白融合蛋白(CPPs-EGFP)、β-葡萄糖苷酶进行共价交联,经Ni-NAT Superflow Cartridge、Sephadex G-75层析柱分离纯化.采用还原型和非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对偶联物进行鉴定；偶联物与膀胱癌EJ细胞共同孵育,置于荧光显微镜下观察,鉴定其穿膜活性；采用β-葡萄糖苷酶测试盒(DBGD-100)鉴定其酶活性.结果 偶联物SDS-PAGE非还原型电泳高分子量端可见明显条带,而还原型电泳分别在穿膜肽和β-葡萄糖苷酶分子量相应位置可见明显条带；在荧光显微镜下与偶联物共同孵育后的膀胱癌EJ细胞内可见明显绿色荧光；用β-葡萄糖苷酶测试盒(DBGD-100)测定,偶联物仍然保持良好的酶活性,约为同等浓度β-葡萄糖苷酶活性的80％.结论 应用SPDP成功制备了穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物,并且偶联物保持良好穿膜活性和酶活性.该方法有助于解决酶·前药系统药物难以进入细胞内的问题.
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苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究
目的 建立苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定的优条件,为进一步阐明苦杏仁炮制原理及储藏养护条件研究提供依据.方法 采用比色法,以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷为底物,考察苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定的佳条件.结果 苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定的佳条件为pH=5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,反应温度50℃,底物浓度50 mmol·L-1,反应时间30 min,于400 nm波长条件下检测β-葡萄糖苷酶活性.结论 确定了测定苦杏仁中-葡萄糖苷酶活性的佳条件,为进一步研究苦杏仁“杀酶保苷”炮制原理、储藏养护条件及储藏期奠定基础.
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鲜地黄中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的提取与初步纯化
目的:从鲜地黄中提取并初步纯化α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶.方法:以总酶活为考察指标,通过正交试验确定两种酶的佳提取条件.以酶活力和蛋白质含量为考察指标,确定两步盐析法的硫酸铵饱和度.结果:提取温度和溶剂量对α-Gal的提取具有显著性影响,而提取溶剂对β-Glu的提取具有显著性影响,因此确定以3倍量(v/w)磷酸盐缓冲液,4℃提取4 h为两种酶的佳提取条件.以30%和60%为两步盐析的佳硫酸铵饱和点.结论:鲜地黄中存在α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶,两步盐析法可以使二者得到初步纯化.
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牛蒡苷元制备方法的研究
目的:对在体外仿生提取牛蒡苷元的制备方法进行研究,优化筛选牛蒡苷元的酶水解条件、提取工艺等,得到适工艺流程.方法:以酶浓度、酶解时间、底物浓度为考察因素,用Box-Behnken设计-响应面分析法对牛蒡苷元水解条件进行优化.结果:牛蒡苷元佳制备条件:转化温度50℃,pH4.8,酶液浓度0.44 U/mL,反应时间46.81 min,底物浓度0.29 mg/mL,牛蒡苷元转化率可达到90.94％.结论:该研究为体外制备牛蒡苷元提供了一定的借鉴价值.
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β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺研究
目的:研究用-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺.方法:采用β-葡萄耱苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ,以转化率为指标,通过单因素试验考察温度、pH值、酶与底物质量比、底物浓度和反应时间对转化率的影响.结果:酶解反应的优化条件为温度50℃、pH=5.0的枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液、酶与底物质量比1:2、底物浓度1 mg·mL-1、反应时间90 min.结论:β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ,转化率高,工艺简单、可靠,反应条件温和.
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抗-CEA单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物特异性激活苦杏仁苷对LoVo细胞的细胞毒作用研究
目的探讨一种新的前药苦杏仁苷在抗体导向酶解前药疗法中对人大肠癌细胞株LoVo的特异性杀伤作用.方法利用苦杏仁苷作前药,台盼蓝拒染法体外观察抗-CEA单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物对苦杏仁苷的特异性激活以及对LoVo细胞的靶向细胞毒作用.结果苦杏仁苷毒性低,而被抗-CEA单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物作用后,细胞毒性增加约40倍,对表达CEA的LoVo细胞具有靶向细胞毒作用; 将LoVo细胞与MCF-7细胞以不同比例同培养发现,此细胞毒作用具有细胞选择性,细胞存活率随LoVo细胞比例的增加而降低.结论抗-CEA单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物能特异性激活苦杏仁苷,对LoVo细胞产生靶向杀伤作用,有可能成为一种新的肿瘤治疗方法,降低化疗的毒、副作用.
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固定化β-葡萄糖苷酶制备人参皂苷F1的研究
本文探讨了β-葡萄糖苷酶的固定化方法,及利用固定化β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rg1为人参皂苷F1的转化工艺.确定交联-包埋法为佳固定化方法,应用正交实验得出佳制备条件为:交联时间3h,戊二醛浓度0.1％,海藻酸钠浓度1％,CaCl2浓度2％.固定化酶与游离酶在热稳定性和pH值稳定性方面显示出不同的性质,其中固定化β-葡萄糖苷酶的适反应温度为70℃,适反应pH值为5.5.固定化β-葡萄糖苷酶在15℃环境中保存30d后,酶活回收率为68.82％.固定化β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rg1为人参皂苷F1的转化条件为:固定化酶承载量为3.76U/g固定化酶载体,底物浓度为0.2mg/mL,转化温度为40℃,转化周期为2d,转化次数为4次,平均转化率为80.49％.
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β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的实验研究
目的 观察β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷对膀胱癌EJ细胞生长及凋亡的影响,探讨β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前药系统用于膀胱癌治疗的应用前景.方法 用不同浓度的苦杏仁苷与β-葡萄糖苷酶共同作用于膀胱癌EJ细胞株,用MTT法检测细胞的增殖活性,倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率与凋亡周期.结果 与单纯用苦杏仁苷作用相比,加入β-葡萄糖苷酶后膀胱癌EJ细胞的增殖明显受限,增值抑制率可以达到前者的8.19倍；倒置显微镜和透射电镜观察到肿瘤细胞呈现凋亡的表现,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率增加、多数肿瘤细胞阻滞于S期,这些改变随着苦杏仁苷浓度的增加而明显增强.结论 β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷后能够明显抑制EJ细胞的增长,其作用机制可能与将肿瘤细胞阻滞于S期而诱导其凋亡有关；β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前药系统可能成为治疗膀胱癌的有效策略.
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黄芩素的酶法提取工艺研究
目的 研究黄芩苷酶解制备黄芩素的方法.方法 用β-葡萄糖苷酶酶解黄芩苷,高效液相色谱法(HPLC)测定酶解率.结果酶活811 U时,黄芩苷∶酶液为0.1 g∶27 mL,pH 4.8,温度51 ℃,搅拌120 min,酶解率达95%以上.结论 黄芩苷酶解制备黄芩素可行,且工艺稳定,重复性好.
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家蝇β-葡萄糖苷酶在Ⅲ龄幼虫消化系统以外器官的表达
目的：探讨家蝇Ⅲ龄幼虫消化系统以外的器官是否产生β-葡萄糖苷酶。方法解剖显微镜下分离马氏管、气管、脂肪体和体壁等器官组织，反转录 PCR 检测β-葡萄糖苷酶基因是否在这些组织中表达；用原位杂交鉴定β-葡萄糖苷酶 mRNA 的组织分布；用纤维素酶抗体免疫组化染色检测纤维素酶的组织定位；用实时荧光定量 PCR 检测β-葡萄糖苷酶在各器官组织的表达差异。结果反转录 PCR 显示，Ⅲ龄幼虫马氏管、气管和体壁组织有β-葡萄糖苷酶基因的扩增产物；原位杂交显示，马氏管、气管和体壁上皮细胞内有β-葡萄糖苷酶 mRNA 分布；免疫组化结果与原位杂交定位基本一致；实时荧光定量 PCR 显示，β-葡萄糖苷酶mRNA 表达量，马氏管＞体壁＞前肠＞气管，差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论家蝇Ⅲ龄幼虫马氏管、体壁和气管皆能分泌β-葡萄糖苷酶。结合家蝇消化系统多器官也具有分泌β-葡萄糖苷酶的特点，以家蝇β-葡萄糖苷酶为靶点的生物防治措施将有望成为减少家蝇传播人类疾病的新方法。
