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093 重组α/β半乳糖苷酶在豆、乳制品中的应用
大豆和牛乳以其丰富的营养价值成为人们生活中不可缺少的食品.但是,存在于大豆和牛乳中的某些低聚糖和乳糖能够引起肠胃胀气,限制了部分人群的食用.α-半乳糖苷酶可以水解大豆中易使肠胃胀气的棉籽糖和水苏糖,制备α-半乳糖基寡糖含量低的豆制品;β-半乳糖苷酶能够水解乳中的乳糖,获得低乳糖乳制品.本文综述了低聚糖引起肠胃胀气的原因以及基因重组α/β半乳糖苷酶在开发低含量寡聚糖的豆、乳制品方面的进展情况.
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Fabry肾病临床病理观察
目的阐明具有肾损害的Fabry病的临床病理特点.方法回顾性分析2例具有肾损害的Fabry病患者的临床表现,并对其肾活检组织进行光镜、免疫荧光及超微结构观察.结果2例患者出现蛋白尿、慢性肾功能不全/慢性肾炎;光镜下可见肾小球脏层上皮细胞空泡变性,远端肾小管上皮细胞、肾小球内皮细胞及系膜细胞、间质成分也可出现泡沫样变;病变晚期,肾小球出现节段性和/或球性硬化;超微结构显示肾小球脏层上皮细胞内具有嗜锇性髓鞘样包涵体,表现为"斑马"样外观.结论Fabry病少见.具有肾损害的患者临床可出现蛋白尿,晚期常发展为肾功能衰竭,肾小球脏层上皮细胞内出现嗜锇性髓鞘样小体是Fabry病特征性的形态学改变.
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异种输血--猕猴受输猪红细胞的初步研究
本研究的目的是改造猪红细胞(pRBC)表面抗原,使之与灵长类动物相容,以探讨异种输血的可能性.结合使用α半乳糖苷酶(AGL)酶解和甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰改造猪红细胞表面异种抗原,并输注给猕猴,观察pRBC在猕猴体内活存时间及安全性;使用免疫抑制剂(蛇毒因子CVF和地塞米松)延长pRBC在猕猴体内的存活时间;建立失血性贫血猕猴模型,观察输注pRBC治疗失血性贫血猕猴的可能性.结果表明:AGL酶解能够去除猪红细胞表面主要异种抗原(α-Gal抗原),减弱其与猕猴血清的凝集反应,酶解技术与mPEG修饰技术结合可以使猪红细胞与猕猴血清更为相容.异种输血试验表明,双修饰的pRBC在猕猴体内存活时间为12小时,使用免疫抑制剂后,可延长至40小时;pRBC在猕猴体内8小时的存活率为38%,在输注pRBC的8小时内,失血猕猴的血红蛋白和红细胞压积可维持在失血前的正常水平.结论:改造后的pRBC可安全地输注给猕猴,改善失血猕猴的贫血症状,提示用猪红细胞进行异种输血是可能的.
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荷斯坦奶牛红细胞作为异种血源的研究
α-Gal抗原是引起异种移植超急性排斥反应的主要异种抗原.本研究探讨新型基因重组α-半乳糖苷酶对荷斯坦奶牛红细胞上的异种抗原的作用.用酶解法清除红细胞表面的α-Gal抗原,用盐水法或抗人球蛋白法进行奶牛红细胞与人血浆的凝集试验,用流式细胞术检测奶牛红细胞表面的α-Gal抗原(FITC-IB4)标记和FITC-IgG标记红细胞的荧光强度.结果表明,盐水法和抗人球蛋白法检测显示,酶解后荷斯坦奶牛红细胞与人混合血清不发生凝集.流式细胞术检测显示,酶解后荷斯坦奶牛红细胞较酶解前其FITC-IB4标记率降低了99.0％,FITC-IgG标记率降低了87.8％.结论:新型α-半乳糖苷酶可以用来清除荷斯坦奶牛红细胞上的α-Gal抗原,且荷斯坦奶牛红细胞的异种抗原主要是α-Gal抗原.酶解法制备的荷斯坦奶牛红细胞可能成为人血替代品.
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新型α-半乳糖苷酶清除动物红细胞表面αGal抗原的研究
异种抗原αGal是引起异种移植免疫排斥反应的重要原因之一.脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶是一种新型的糖苷酶,能够切除支链多糖和直链多糖末端的αGal残基.本研究探讨新型α半乳糖苷酶清除红细胞表面αGal抗原的作用.利用新型的基因重组α-半乳糖苷酶酶解牛、猪、狗、兔红细胞上的异种抗原,并用流式细胞术分析细胞表面的αGal抗原.结果表明,动物红细胞表面的异种抗原αGal被完全或部分清除.结论:新型α-半乳糖苷酶可以用来清除异种红细胞上的αGal抗原,对降低异种移植引起的超急性排斥反应具有潜在意义.
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α-半乳糖苷酶及其在输血等方面的应用
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-Gal, E.C.3.2.1.22)是广泛存在于自然界中的一种外切糖苷酶,传统上划分为两类异构酶,即α-半乳糖苷酶A和α-半乳糖苷酶B.在体内,α-半乳糖苷酶A水解以α-半乳糖残基为末端的糖复合物,而α-半乳糖苷酶B则水解以α-N-乙酰-氨基半乳糖残基为末端的聚糖及糖蛋白、糖脂等复合物,因而它实际上是一种α-N-乙酰-半乳糖胺酶.近年来,对于这两种异构酶的研究不断深入,并应用于人血型转换、异种器官移植及溶酶体贮积病的病理研究等方面,已展示出α-半乳糖苷酶在临床应用上的诱人前景.
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一个Fabry病家系的GLA基因突变分析
目的对一个临床诊断的非典型Fabry病患者进行α半乳糖苷酶基因(GLA)进行突变分析.方法抽取患者家系中4名成员的外周血基因组DNA,PCR分段扩增位于Xq22的GLA基因的7个外显子,产物纯化后直接进行DNA测序检测突变.结果测序显示,男性患者GLA基因的第6外显子存在CGA301CAA(Arg301Gln)突变,该患者为带有突变基因的半合子,母亲为携带突变基因的杂合子,哥哥及父亲为CGA301野生型的半合子.结论对临床诊断的Fabry病患者及其亲属,进行GLA基因突变检测可以进行基因诊断,并有助于早期筛选出家系中的其他患者.
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咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性检测
目的:初步证实咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性.方法:通过PCR扩增得到咖啡豆α-半乳糖苷酶基因克隆到载体pGEM-T easy,目的片段与预期的大小一致.咖啡豆α-半乳糖苷酶基因与分泌性原核表达载体pAS18连接,转化到宿主菌E.coli JM83.经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳分析,Western-blot印迹证实蛋白表达的特异性.结果:PCR扩增得到目的片段测序结果正确.SDS-PAGE电泳分析得到目的蛋白41 kD,经过Western blot鉴定正确.ELISA检测证实咖啡豆α-半乳糖苷酶具有生物活性.结论:优化诱导条件,初步证实重组咖啡豆α-半乳糖苷酶基因具有生物活性.
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α-半乳糖苷酶转换人体肝脏血型的实验研究
目的 研究α-半乳糖苷酶对人体肝脏血型抗原的清除效果,探讨肝脏血型转换的可行性.方法 采用肝移植手术中B血型病肝建立离体肝脏的灌注模型.用UW液+/-α-半乳糖苷酶灌注离体肝脏,免疫荧光分析酶对肝脏B抗原的清除效果.结果 用含α-半乳糖苷酶的UW液灌注离体肝脏,免疫组化显示,低温灌注保存后的肝脏血型抗原的含量明显降低.灌注后1hB抗原减少至灌注前平均水平的58％、2h为10％、4h为4％.不同时间血型抗原水平差异有统计学意义(P＜0.05).对照组血型抗原水平未见明显的变化.结论 α-半乳糖苷酶可以有效清除人的离体肝组织B抗原.虽然并未达到不可测水平,但可基本实现人体器官肝脏B→O的血型转换,对研究人体器官的血型转换有重要意义.
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酶解法清除猪皮α-Gal抗原的研究
目的 利用脆弱拟杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪皮细胞及基质的异种抗原(α-Gal抗原) ,降低猪皮基质敷料的免疫原性. 方法 2月龄健康无皮肤疾患的猪皮皮片,经剖层裁切成不同的规格后,分别经碘酊和75%乙醇溶液浸泡消毒,随后用PBS清洗后进行酶解条件的摸索;采用免疫荧光法检测猪皮的α-Gal抗原,双抗夹心ELISA法检测残留酶,通过对酶解猪皮的残留酶和α-Gal抗原的检测进而优化、改进酶解条件和洗涤条件,以确立佳酶解工艺. 结果 建立了有效的酶解方法和洗涤方法,酶解后猪皮的α-Gal抗原清除率>90%,残留酶不能检出(间接ELISA法检测微量α-半乳糖苷酶的下限为1 ng/ml). 结论 所建立的酶解工艺和洗涤工艺可有效清除猪皮细胞及基质的α-Gal抗原,建立了制备低免疫原性猪皮敷料的方法.
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基因重组α-半乳糖苷酶的生化性质研究
目的:在成功构建咖啡豆α-半乳糖苷酶毕赤酵母工程菌株及完成基因重组α-半乳糖苷酶发酵与纯化研究的基础上,对基因重组α-半乳糖苷酶的生物化学性质进行研究.方法:测定了基因重组α-半乳糖苷酶的N端序列、相对分子质量、氨基酸组成、三批发酵产物的紫外吸收光谱和肽图以及Vmax、Km、适反应温度、适反应pH值等酶的生化性质.结果与结论:基因重组α-半乳糖苷酶的N端序列与理论序列完全一致;氨基酸组成与理论值相符;相对分子质量为39.4×103.三批发酵产物的紫外光谱吸收和肽图基本一致,表明发酵纯化后的产物稳定;Km=0.275 mmol/L,大酶促反应速度Vmax=0.014 mmol/min;适反应温度为37℃,适反应pH值为5.6.
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B→O血型改造制备通用型血过程中残留工具酶的检测
目的:检测B→O血型改造制备通用型血过程中的残留工具酶-α-半乳糖苷酶.方法:血清学反应确定α-半乳糖苷酶残酶量安全值,用SDS-PAGE银染法和酶活性检测法测定通用型血中微量残留工具酶量.结果:确定了α-半乳糖苷酶残酶量安全值为10 ng/ml,建立了检测微量残留α-半乳糖苷酶的方法.确定经过6～7次洗涤后,残留酶量可达到安全水平.结论:本研究为B→O血型改造制备的通用型血进一步的临床应用奠定了基础.
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重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性鉴定
α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)属外切糖苷酶类,可特异性水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的α-半乳糖苷键. α-半乳糖苷酶被广泛应用于农产品加工、人B→O血型改造、异种移植、清除异种抗原以及治疗遗传性疾病法布莱病等[1～3].然而,用生化提取技术无法获得高产量、高纯度的酶.利用DNA重组技术,制备可表达α-半乳糖苷酶的工程菌株是解决这一问题的有效方法[4].为了满足临床和科研工作对α-半乳糖苷酶的需求,本室已构建了高效表达α-半乳糖苷酶的工程菌pPIC9K-Gal/GS115[5,6].为了研究该菌株的稳定性,按照国家SDA对基因重组产品的要求,我们对该菌株在传代过程中的生长特性、遗传和表达稳定性等进行了鉴定.
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α-半乳糖苷酶活性测定方法的研究
目的: 应用分光光度法建立一种简便、准确、灵敏、稳定的重组α-半乳糖苷酶(AGA)活性检测方法.方法: 利用紫外-可见分光光度计,根据产物生成量计算所测标本的酶活性.结果:该方法的批内变异系数为2.63%,批间变异系数为4.42%,均＜5%;在所检测该酶质量浓度范围(0.3～2.5 μg/ml) 内线性关系良好;每组的平均回收率均在95%～105%之间.结论:与已经建立的测活方法相比较,该方法具有无需酶的标准品,结果可靠、误差小、稳定性好、操作简单,适合实验室及工业化生产应用的优点.
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制备脆弱拟杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶单抗用于检测通用型红细胞中的微量残留酶
目的：建立一种检测微量脆弱拟杆菌（ Bacteroides fragilis）来源的α-半乳糖苷酶的方法用于测定酶解转变的通用型红细胞上的残留酶。方法用脆弱拟杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫BALB／c小鼠，制备单抗；用稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株制备腹水单抗，再经HiTrap rProtein A柱纯化获得高纯度的抗体；间接ELISA法测定单抗效价，Western 印迹法评价单抗特异性。联合纯化后的单抗和兔多抗采用间接ELISA法检测酶解法制备的通用型红细胞和洗涤液中的残留酶量。结果获得了高效价高纯度的单抗，Western 印迹实验显示该抗体可特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合；间接ELISA法检测微量α-半乳糖苷酶的下限为1 ng／ml，红细胞按1∶4的体积比经4次洗涤后，其残留酶量＜10 ng／ml。结论所建立的在血型转变过程中检测微量残留α-半乳糖苷酶的方法，可用于酶解法制备的通用型红细胞的安全性评价。
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以反复缺血性脑卒中为突出表现的法布雷病1例报道及家系分析
目的 对一个以反复脑卒中为主要临床表现的法布雷病(Fabry病)家系进行调查,分析其临床特点和基因突变情况.方法 收集该例先证者及其家族成员的临床表现、头颅MRI检查资料.对先证者行皮肤活检,检测α-半乳糖苷酶A(α-galA)的活性.提取先证者及其弟弟、母亲的血液,进行DNA测序.结果 家系中3例患者均出现反复发作脑卒中,伴有肢端疼痛、皮肤血管角质瘤及少汗等表现.影像学均表现为基底节、脑干多发性腔隙病变.皮肤组织电镜下可见血管内皮细胞及周细胞内大量次级溶酶体结构,次级溶酶体内似有指纹结构.先证者α-galA活性明显下降,GLA基因检测发现c.672T＞G,p.N224K半合子突变(男性X染色体纯合突变).结论 Fabry家系以基底节和脑干反复脑卒中为突出临床表现,具有典型的病理学和酶学证据,GLA基因检测发现c.672T＞G,p.N224K半合子突变,该突变未见文献报道.
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α-半乳糖苷酶的医学研究进展
本文综述α-半乳糖苷酶在医学领域的应用,分析α-半乳糖苷酶与Fabry疾病、血型转换和异种器官移植的关系和研究进展.
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转基因克隆猪与人类异种器官移植
利用猪的器官来解决当前人源器官严重短缺,为解决移植器官短缺的可行的途径,直接并准确地对α-1,3半乳糖苷转移酶(α-l,3GT)基因进行同源重组,使α-1,3GT失活,再结合猪体细胞克隆技术,对其进行人源化改造,减弱或消除排异反应.然而,猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)为异种器官移植的主要障碍.因此,既要剔除导致人类排异反应的排斥基因,又要确保猪器官异种移植的安全性.
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α-半乳糖苷酶A缺乏对凝血因子V Leiden小鼠组织纤维蛋白沉积和血栓形成的影响
目的 评价α-半乳糖苷酶A(Gla)缺乏与凝血因子V(FV)Leiden(FVL)在体内对血栓形成的影响.方法 建立Gla与FVL基因复合突变小鼠,并分析其器官组织纤维蛋白沉积和血栓形成情况.结果 在FVL存在情况下,野生型小鼠组织器官纤维蛋白沉积[Gla+/0 FV Q/Q,(0.08±0.05)%]较Gla缺乏型[Gla-/0 FV Q/Q,(0.24±0.07)%)]显著降低(P＜0.01),Gla缺乏型纯合子小鼠组织器官纤维蛋白沉积[Gla-/-FV Q/Q,(0.32±0.03)%)]较Gla野生型[Gla+/+FV Q/Q,(0.06±0.01)%)]显著增加(P＜0.05);同时Gla缺乏型小鼠(Gla-/-FV Q/Q和Gla-/0 FV Q/Q)血栓数目[(1.9±0.7)个]亦显著高于Gla野生型小鼠(Gla+/+FV Q/Q和Gla+/0 FV Q/Q)的血栓数目[(0.3±0.1)个](P＜0.05).结论 Gla缺乏加重FVL突变小鼠的组织纤维蛋白沉积和血栓形成,提示Cla缺乏可能是重要的增强FVL患者血栓形成的遗传因素,临床上FVL患者出现早发和严重的血栓疾病可能合并其他遗传性血栓相关的基因缺陷.
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猕猴类人血型抗原B酶解的研究
目的:研究α-半乳糖苷酶对猕猴类人血型抗原B的酶解,为制备人O型红细胞提供依据.方法:以重组的α-半乳糖苷酶对猕猴类人血型抗原酶解B,观察红细胞酶解前后各项生化指标的变化及动物输血试验.结果:酶解后红细胞的形态、各项生化指标及功能正常.酶解红细胞回输后受体猕猴的血压、脉搏、呼吸与输血前相比无明显变化,酶解红细胞输血后体内的24小时存活率为96.5%和95.0%,半衰期均为16天,对照组红细胞在体内的24小时存活率为97.1%,半衰期为16天.受体猕猴的血液、尿液等主要生化指标与输血前相比无显著性差异(P＞0.05).结论:α-半乳糖苷酶可以清除猕猴红细胞表面的类人B抗原,并且对猕猴红细胞的形态和功能无不良影响,酶解后红细胞输给同种异型受体不发生输血反应.提示人类ABO血型改造是可行的.
