应用抑制性消减杂交技术筛选HBxAg蛋白结合蛋白XBP1的上调基因
摘要： 目的 应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBxAg蛋白结合蛋白XBP1,为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆XBP1蛋白反式激活的靶基因.方法 以XBP1表达质粒pcD-NA3.1(-)-myc-his(A)-XBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照；制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人XBP1蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到80个200～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得28个已知编码序列基因和2个未知的新基因.结论 XBP1在肝细胞内表达后能够上调HepG2细胞中许多不同基因表达的变化,这些基因与细胞信号转导、细胞增殖与分化、免疫应答、能量代谢、细胞凋亡、肿瘤发生等生物过程密切相关.
-
芳香化酶P450、ER β在宫颈癌组织的表达及临床意义
目的 探讨芳香化酶P450、ER β在正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌周组织的表达差异,进而探讨其临床意义.方法 对西安交通大学医学院第二附属医院2004年至2008年手术切除的正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌周组织存档蜡块标本各30例,用免疫组化SP法检测其表达.结果 芳香化酶P450在正常宫颈组织、癌周组织和宫颈癌组织的表达率分别为0%(0/30)、0%(0/30)和36.7%(11/30),经比较有显著性差异(P<0.05),而正常宫颈组与癌周组织组的表达无显著性差异(P>0.05).ER β在正常宫颈组织、癌周组织和宫颈癌组织的表达率分别为73%(22/30)、70%(21/30)和36.7%(11/30),相比较有显著性差异(P<0.05),而正常宫颈组织与癌周组织的表达无显著性差异(P>0.05).结论 芳香化酶P450在宫颈癌组织的阳性表达可能参与宫颈癌的发生;ER β在宫颈癌组织的阳性表达率低,可作为预测宫颈癌变及宫颈癌预后良好的一项参考指标.
-
生长分化因子5单核苷酸多态性与大骨节病的相关性
目的 探讨生长分化因子5(GDF5)基因3个单核苷酸多态性(SNP)位点多态性与大骨节病的关系.方法 用限制性核酸内切酶酶切方法对103例大骨节病患者和91例健康人的GDF5基因上的3个SNP位点进行基因分型,计算相应人群中3个位点的基因型频率,比较各组间基因型频率的差异.结果 单倍型重构分析显示单倍型AT、TGC和 TAT在大骨节病患者和健康人群之间存在差异,但3个位点单位点关联分析未显示与大骨节病具有相关性.结论 单倍型TGC与大骨节病具有相关性.
-
依曲替酸对寻常型银屑病皮肤IFN-γ、IL-4 mRNA表达的影响
目的 探讨依曲替酸治疗寻常型银屑病(psoriatic vulgaris, PV)的作用机制.方法 观察依曲替酸对30例PV患者的临床疗效,并用原位杂交技术对患者治疗前后皮损中Th1型细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4)mRNA进行检测.结果 依曲替酸能改善PV患者病情,有效率76.67%.IFN-γ、IL-4 mRNA主要在真皮表皮交界处的淋巴细胞胞质中表达,IFN-γ mRNA的表达治疗前(45.61±9.96)明显高于正常对照(4.40±1.20,P<0.01),治疗后(16.82±7.20)明显下降(P<0.01).IL-4 mRNA表达无显著变化.结论 依曲替酸治疗PV的作用机制可能与其抑制皮肤中IFN-γ mRNA的表达及调节Th平衡有关.
-
胱抑素C及其他标志物诊断糖尿病肾病效能的比较
目的 探讨血清胱抑素C(CysC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)及β2微球蛋白(β2-MG)和尿微量白蛋白(m-Alb)对于诊断糖尿病肾病的临床意义.方法 选择197例2型糖尿病(T2DM)患者,常规方法测定Scr及BUN;用放免法测定血β2微球蛋白和尿微量白蛋白,用99mTC-DTPA法检测肾小球滤过率(GFR),用PENIA法测定血CysC.并比较各观察指标AUCROC.结果 在早期糖尿病肾病,CysC的曲线下面积均大于Scr、BUN、β2-MG及m-Alb,且差异有统计学意义(P<0.05);而且,血清CysC水平与GFR呈明显负相关(P<0.01).结论 血清CysC对于糖尿病肾病的诊断较Scr、BUN、β2-MG、m-Alb更为敏感;并可以较准确地反应GFR,是判断肾功能损害程度的敏感指标,有很好的临床价值.
-
硫酸镁对重型颅脑损伤患者血清IL1β、TNFα浓度的影响
目的 研究硫酸镁对sTBI患者血清IL1β和TNFα浓度的影响,进一步探讨镁离子保护创伤神经元的机制.方法 将入选病例随机分为治疗组和对照组,每组30例.对照组按常规治疗,治疗组加用硫酸镁.正常组20例,为成年健康献血员.按预设时间抽取肘静脉血,采用原子分光光度法和放射免疫法分别测定血清Mg2+与IL1β、TNFα浓度.应用SPSS13.0软件包分析数据.结果 sTBI后血清IL1β和TNFα浓度24h内即明显升高,3d达到高峰,以后逐渐下降;治疗组患者血清IL1β浓度于伤后2、3、7d和TNFα于伤后2、3d明显低于对照组(P<0.01或P<0.05).结论 sTBI患者伤后早期即出现血清IL1β和TNFα浓度升高;早期应用硫酸镁治疗能明显抑制sTBI患者急性期炎症反应,保护神经功能.
-
肾清饮对腺嘌呤致肾间质纤维化大鼠肾脏TGF-β1及TIMP-1表达的影响
目的 探讨肾清饮抑制肾间质纤维化的可能机制.方法 采用腺嘌呤灌胃法建立大鼠肾间质纤维化动物模型,并给予肾清饮和盐酸苯那普利干预治疗,作肾脏病理学检查,并以免疫组化和RT-PCR方法分别检测大鼠肾脏转化生长因子β1(TGF-β1)、金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)的表达.结果 各肾清饮干预组肾组织肾间质纤维化程度轻于模型对照组,免疫组化和RT-PCR检测的肾脏TGF-β1、TIMP-1的表达量均少于模型对照组(P<0.05).结论 肾清饮可通过减少肾组织TGF-β1、TIMP-1的表达,抑制肾间质纤维化的进展.
关键词： 肾清饮 肾间质纤维化 转化生长因子β1 金属蛋白酶组织抑制物-1 -
Y-box结合蛋白-1在胃癌组织中的表达及意义
目的 研究Y-box结合蛋白-1(YB-1)在胃癌的不同发展阶段中的表达及其意义.方法 采用免疫组织化学和原位杂交方法检测正常胃组织、肠化生组织、早期胃癌和进展期胃癌组织中YB-1蛋白和mRNA的表达变化.结果 在正常胃组织中YB-1蛋白和mRNA无表达;在肠化生组织中可见YB-1阳性染色于胃黏膜上皮细胞中,但表达较弱;在早期胃癌中YB-1表达于全层胃黏膜上皮细胞中,染色较肠化生组织重,而在进展期胃癌中其表达较在早期胃癌中下降.结论 YB-1的升高可能在胃癌的早期发生和发展中起作用.
关键词： 胃癌 Y-box结合蛋白-1 免疫组织化学 原位杂交 -
中国人丙型肝炎病毒复合细胞毒性T淋巴细胞多表位基因真核载体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的 构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复合细胞毒性T淋巴细胞(CTL)多表位基因的真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达.方法 根据生物信息学方法筛选中国人的HCV多个CTL优势表位,合成复合多表位抗原基因(mcf);将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1,转染COS-7细胞,在荧光显微镜下观察mcf-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位,RT-PCR及Western blot检测其mRNA及蛋白表达.结果 成功构建了真核表达载体pEGFP-mcf.将构建的真核表达载体pEGFP-mcf转染 COS-7细胞后,绿色荧光分布于COS-7细胞胞质中;而转染空载体pEGFP-N1后,绿色荧光弥散分布于COS-7细胞胞核及胞质中.RT-PCR检测到转染细胞中mcf mRNA表达;Western blot结果证明合成mcf可在COS-7细胞中表达.结论 该真核表达载体的成功表达及鉴定,为下一步中国人的HCV复合CTL多表位疫苗的研究奠定了基础.
-
全反式维甲酸与奥沙利铂在诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡中的协同作用
目的 观察全反式维甲酸(ATRA)与奥沙利铂(L-OHP)对人胃癌BGC-823细胞增殖的影响.方法 分别用ATRA和L-OHP单独及联合作用于人胃癌BGC-823细胞,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,倒置显微镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期;免疫细胞化学技术检测BGC-823细胞中Bcl-2和Survivin蛋白的表达情况.结果 ATRA作用后BGC-823细胞的增殖受到抑制,细胞形态发生了改变,凋亡比例明显增加;与L-OHP联用后,该作用加强.胃癌 BGC-823细胞中Bcl-2和Survivin蛋白的表达在ATRA作用后均受到抑制,ATRA与L-OHP联合作用后蛋白表达的阳性率进一步降低.结论 ATRA能抑制人胃癌BGC-823细胞的生长,与L-OHP联用具有协同抑制作用,其机制可能与下调Bcl-2和Survivin蛋白表达有关.
-
雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌SKOV-3细胞增殖的抑制作用
目的 探讨雷帕霉素单独及联合顺铂应用对人卵巢癌SKOV-3细胞生长的影响及可能的分子机制.方法 体外培养人卵巢癌SKOV-3细胞,实验组分别采用不同浓度的雷帕霉素、顺铂及40nmol/L雷帕霉素+10μmol/L顺铂作用,MTT法检测上述药物对细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测分析细胞凋亡率及细胞周期分布变化.结果 雷帕霉素单独及联合顺铂应用均可显著抑制人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖,其作用呈现时间-剂量依赖性,且两药联合作用时抑制率显著增高(P<0.05),显示两药有协同作用;流式细胞仪检测显示雷帕霉素能使卵巢癌SKOV-3发生G1期阻滞,同时可诱导细胞凋亡,其凋亡率随用药浓度增加而增加.结论 雷帕霉素和顺铂可显著地抑制人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,且两药联合应用时呈现协同作用.
关键词： 雷帕霉素 顺铂 卵巢癌SKOV-3细胞 细胞周期 细胞凋亡
