胰腺癌细胞PANC-1中LSD1负向调控抑癌基因SIRT3的实验研究
摘要： 背景与目的：组蛋白赖氨酸去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是重要的染色质修饰蛋白之一，可以通过调节染色质的结构调节基因的转录调控，进而影响肿瘤的发生、发展、侵袭、转移以及代谢异常等恶性潜能，是判断肿瘤预后的生物标志物。Sirtuins家族去乙酰化酶3(sirtuin3，SIRT3)基因是位于线粒体内的抑癌基因，通过调控肿瘤代谢异常以及氧化损伤行使抑癌基因的功能。本研究通过基因转录调控的手段，研究胰腺癌细胞PANC-1中LSD1与SIRT3的关系。方法：通过RNA干扰(RAN interference， RNAi)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，CoIP)、染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)及启动子活性分析等分子生物学实验手段，探讨LSD1与SIRT3在PANC-1细胞中的关系。结果：通过RNAi的手段干扰LSD1的表达，发现SIRT3基因转录水平和蛋白水平明显上升；通过蛋白相互作用的手段，发现LSD1可以与SIRT3转录调控的重要转录因子过氧化物酶增殖体激活受体辅激动子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,coactivator 1 alpha，PGC-1α)相互作用；通过ChIP方法，发现LSD1与PGC-1α共同募集到SIRT3基因的启动子区域染色质上；通过启动子活性分析，发现LSD1基因可以显著抑制PGC-1α对SIRT3基因的转录调控。结论：LSD1可以表观遗传调控抑癌基因SIRT3的转录，为深入研究LSD1与肿瘤代谢异常以及氧化应激提供了理论依据。
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超声筛查乳腺癌模式在基层医院应用的研究
背景与目的:乳腺癌是影响成年女性的主要慢性疾病之一,我国乳腺癌的发病率正以每年3％～4％的速率增长,严重危害女性的身体健康和生命安全.本研究旨在分析超声筛查乳腺癌模式在基层医院推广应用的可行性,探讨应用超声检查早期发现和诊断乳腺癌的价值.方法:采用基于超声筛查乳腺癌的模式,选择35～60岁哈密地区户籍的各民族妇女进行群体乳腺癌筛查,全部妇女先行乳腺超声检查,对乳腺影像报告与数据系统(Breast Imagine Reporting and Data System,BI-RADS)分级为4级和5级的行活检,0级和3级的补充乳腺X线检查,1级和2级的随访.结果:2012年1月—2017年10月全地区在本院累计完成乳腺癌检查184680人,其中149例确诊为乳腺癌,乳腺癌检测率80.68/10万,建议行乳腺X线检查3203人次,实际乳腺X线检查2675人次;建议活检582人次,实际活检582人次;早期乳腺癌比例:0期36.24％,Ⅰ期51.00％,Ⅱ期10.07％,Ⅲ期2.68％,0+Ⅰ+Ⅱ期97.31％,0+I期87.24％.灵敏度和特异度:乳腺超声筛查出122例乳腺癌(81.88％),X线检查出27例(18.12％).35～39岁组乳腺癌检出率为8.56/10万,40～50岁组检出率为29.20/10万,51～60岁组检出率为42.71/10万.回族妇女乳腺癌检出率显著高于其他民族(P<0.05),其次为维吾尔族妇女.结论:超声筛查乳腺癌模式在基层医院易于推广,实际操作过程中筛查对象的依从性较好,易于普及,在乳腺癌的检出、早期诊断等方面效果明显.
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鳞状细胞癌抗原检测联合磁共振成像对判断早期宫颈癌盆腔淋巴结转移的临床意义
背景与目的:宫颈癌是否发生淋巴结转移不仅决定着预后,还指导着术后辅助治疗;因此对淋巴结转移进行相关研究具有重要的意义.本文皆在分析宫颈癌发生盆腔淋巴结转移的相关因素,探讨鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCAg)检测联合磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)对宫颈癌盆腔淋巴结转移的临床应用价值.方法:回顾性分析2016年7月—2018年3月在蚌埠医学院第一附属医院治疗的ⅠA～ⅡA期110例宫颈鳞癌患者的临床相关资料;采用SPSS 22.0软件进行相关统计学分析.结果:SCCAg检测判断宫颈癌盆腔淋巴结转移的受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线的曲线下面积为0.695,佳临界值为2.45 ng/mL,95％CI为0.577～0.812,其阳性预测值为46％,阴性预测值为84％,准确率为71％,灵敏度为58.6％,特异度为75.3％(Kappa值=0.312,P=0.001);术前MRI检查诊断宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移的阳性预测值为77％,阴性预测值为89％,准确率为86.4％,灵敏度为69.0％,特异度为92.6％(Kappa值=0.637,P=0.000);两者联合诊断宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移的阳性预测值为55％,阴性预测值为97％,准确率为78.1％,灵敏度为93.1％,特异度为72.8％(Kappa值=0.540,P=0.000);单因素分析显示,淋巴结转移与SCCAg>2.45 ng/mL、间质浸润深度、切缘浸润及脉管浸润有关;多因素分析显示,间质浸润及脉管浸润是盆腔淋巴结转移的独立危险因素.结论:宫颈癌盆腔淋巴结转移与SCCAg>2.45 ng/mL、间质浸润深度、切缘浸润及脉管浸润相关,尤其当有间质浸润及脉管浸润时,淋巴结转移的可能性更不可忽视;而在诊断淋巴结转移方面,MRI要优于SCCAg检查,当两者结合可显著提高其灵敏度及阴性预测值,对宫颈癌无盆腔淋巴结转移的判断具有重要的临床意义.
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CRISPR-Cas9敲除Notch1对CNE2细胞增殖及辐射敏感性的影响
背景与目的:Notch信号转导通路对鼻咽癌的发生、发展及维持肿瘤干细胞的自我更新等具有重要作用,既往研究方法难以使Notch通路中特定基因功能完全丧失.本研究旨在利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Notch1基因敲除的CNE2鼻咽癌细胞系,并观察Notch1敲除对CNE2细胞增殖、辐射敏感性的影响.方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测人鼻咽癌细胞CNE2及鼻咽正常上皮细胞NP69中Notch1表达水平;利用sgRNA在线设计工具,针对Notch1设计sgRNA;利用PX459质粒构建含sgRNA的敲除载体PX459-Notch1-sgRNA;将质粒瞬时转染CNE2细胞,经过药物筛选、克隆化培养、Western blot检测、免疫荧光染色验证得到Notch1敲除的CNE2鼻咽癌细胞系;采用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测方法、克隆形成实验检测Notch1敲除组(Notch-KO)与未转染亲本组(Parental)、转染PX459空载体水平较的对照组(Ctrl)的增殖活性及辐射敏感性,并进一步采用流式细胞术检测侧群细胞比例.结果:与NP69细胞相比,CNE2细胞中Notch1蛋白水平较高;Western blot检测、免疫荧光染色验证Notch1基因被完全敲除.Notch1基因敲除可抑制细胞增殖活性(P<0.05);Notch1-KO组的D0、Dq和SF2值分别为1.160、1.881和0.630 Gy,低于Parental(1.176、2.533和0.824 Gy,P<0.001)和Ctrl组(1.182、2.516和0.819 Gy,P<0.001);Notch1-KO中侧群细胞比例[(1.13±0.01)％]较Parental[(3.81±0.03)％]、Ctrl[(3.70±0.03)％]明显下降(P<0.001).结论:运用CRISPR-Cas9技术可成功敲除CNE2细胞中的Notch1基因,Notch1基因敲除导致CNE2细胞增殖能力下降、辐射敏感性增加、侧群细胞比例降低.
关键词： Notch1基因 CRISPR-Cas9 鼻咽癌 辐射敏感性 -
分化型甲状腺癌131I治疗前刺激性Tg与佳治疗反应的关系
背景与目的:初始治疗(手术+131I+TSH抑制)后的疗效反应对动态评估患者的复发风险至关重要.本研究旨在探讨131I治疗前刺激性甲状腺球蛋白(preablative-stimulated thyroglobulin,ps-Tg)对佳治疗反应的预测价值.方法:纳入中位随访74.5个月的分化型甲状腺癌(di▲erentiated thyroid carcinoma,DTC)患者136例,根据治疗反应评估体系将其治疗效果分为4组:佳治疗反应(excellent response,ER)(86例)、疗效不确切(indeterminate response,IDR)(18例)、血清学反应欠佳(biochemical incomplete response,BIR)(4例)和影像学反应欠佳(structural incomplete response,SIR)(28例).采用χ2检验、Fisher精确检验和Kruskal-Wallis秩和检验比较4组患者的基本临床特征,建立ps-Tg及肿瘤大小与ER关系的受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线获得佳界值点,对影响ER的因素进行多因素分析,进一步采用Kaplan-Meier曲线评估ps-Tg及肿瘤大小发生非ER的累积风险,使用log-rank法对差异进行统计学分析.结果:4组间ps-Tg水平、肿瘤大小、腺外侵犯、多灶性、淋巴结分期以及TNM分期差异有统计学意义(P<0.05),而性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05).ps-Tg以及肿瘤大小与ER关系的ROC曲线下面积分别为0.865和0.666,当ps-Tg以9.05 ng/mL为界值预测ER时,灵敏度和特异度较高(分别为83.7％和80.0％),肿瘤直径以1.05 cm为界值点时的灵敏度和特异度分别为53.5％和72.0％.多因素分析显示ps-Tg和肿瘤大小可以作为预测ER的独立因素(OR=20.571,P=0.015;OR=3.291,P=0.008).随着肿瘤直径的增大,ps-Tg≥9.05组患者的非ER风险明显高于ps-Tg<9.05组(P=0.0003).结论:ps-Tg(界值点为9.05 ng/mL)可用于预测本组患者佳治疗反应,其与肿瘤大小结合可以更全面地预测初始治疗后的疗效.
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中国BRCA1/2突变阳性和突变阴性乳腺癌病理学特征的比较性研究
背景与目的:BRCA1和BRCA2是两个主要的遗传性乳腺癌相关基因,本研究旨在发现中国BRCA1/2突变阳性乳腺癌的病理学特征.方法:本研究入组了2012—2016年间287例接受过BRCA1/2基因突变检测的乳腺癌,对其中BRCA1/2突变阳性和突变阴性患者的组织病理学和免疫组织化学检测结果进行了比较性研究.结果:在287例乳腺癌中,66例为BRCA1突变阳性,47例为BRCA2突变阳性,174例为BRCA1/2突变阴性.BRCA1突变的乳腺癌表现为更高的组织学分级(P<0.001),更高比例的三阴性乳腺癌(72.7％,P<0.001).BRCA1突变阳性和BRCA2突变阳性的乳腺癌中人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的阳性表达率较BRCA1/2突变阴性的乳腺癌更低(P<0.001).BRCA1突变阳性乳腺癌基底标志物细胞角蛋白5/6(cytokeratin 5/6,CK5/6)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的阳性率为50％,明显高于其他两组(P<0.001),雄激素受体(androgen receptor,AR)的阳性率也更低(P<0.05).结论:中国BRCA1突变阳性乳腺癌更多为三阴性乳腺癌,具有CK5/6和EGFR的阳性率更高等特点,并且BRCA1和BRCA2突变阳性乳腺癌中HER2受体阳性率也更低.
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99mTc-转铁蛋白-DTPA-Gd核素/磁性双模态分子影像探针基于转铁蛋白受体表达水平的肿瘤成像
背景与目的:转铁蛋白(Holo-Transferrin,Tf)受体(transferrin receptor,TfR)广泛存在于恶性肿瘤细胞膜表面,并被认为是抗肿瘤治疗的靶点.本研究旨在探讨99mTc-Tf-DTPA-Gd在体、无创性检测多种人源性肿瘤TfR表达情况的可行性.方法:制作10种人肿瘤细胞的BALB/c裸小鼠移植瘤模型;经荷瘤鼠尾静脉注射99mTc-Tf-DTPA-Gd或Tf-DTPA-Gd 4 h后行单光子发射计算机断层摄影术(single-photon emission computed tomography,SPECT)/计算机断层摄影术(computed tomography,CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查,勾画感兴趣区(region of interest,ROI),计算靶本比值即靶区/肌肉组织(target-to-muscle ratios,T/M)或相对信号增强值(relative signal enhancement,rSE);显像结束后取肿瘤组织行H-E染色及免疫组织化学染色,采用H-score法评估10种肿瘤表达TfR水平.选用两样本t检验及Spearman分析数据.结果:10种移植瘤模型均可用于成像.注射双模态探针4 h后,有9种肿瘤摄取99mTc-Tf-DTPA-Gd,其中胶质瘤细胞U87的T/M值高,乳腺癌细胞MDA-MB-468也有较高的T/M值;而前列腺癌细胞PC-3肿瘤几乎不摄取,T/M值接近1,与MDA-MB-468 T/M值相比差异有统计学意义(t=6.919,P=0.002).MRI显示,MDA-MB-468肿瘤强化明显,rSE达(154.88±8.71)％,而PC-3肿瘤为(111.31±3.46)％,差异有统计学意义(t=8.441,P=0.001).PC-3肿瘤几乎不表达TfR,其余9种肿瘤均不同程度地表达TfR.TfR免疫组织化学检测结果与探针的T/M值呈明显的正相关(相关系数为r=0.915,P<0.001).结论:99mTc-Tf-DTPA-Gd可在体、无创性反映肿瘤表达TfR受体情况.
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乳腺癌新辅助化疗后内乳区前哨淋巴结活检研究
目的:新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NAC)目前已成为局部晚期乳腺癌患者的标准治疗模式.本研究旨在评估乳腺癌患者在NAC后接受内乳区前哨淋巴结活检(internal mammary sentinel lymph node biopsy,IMSLNB)的临床获益.方法:回顾性分析2014年4月—2018年4月山东大学附属山东省肿瘤医院乳腺病中心收治的202例接受NAC的原发性乳腺癌患者的临床资料并进行统计分析,入组患者术前均采用"新型注射技术"注射核素示踪剂.术前哨位淋巴结显像和(或)术中γ探测仪发现内乳区前哨淋巴结(internal mammary sentinel lymph node,IMSLN)显像者行经肋间IMSLNB.根据目前的指南评估NAC后接受IMSLNB的临床获益.结果:入组202例患者,NAC后IMSLN显像率为34.2％(69/202),且与临床肿瘤分期相关(P=0.017),IMSLN显像患者中,临床淋巴结阴性和临床淋巴结阳性(clinical lymph node-positive,cN+)患者分别占11.6％(8/69)和88.4％(61/69).NAC后IMSLNB的成功率为98.6％(68/69),IMSLN的检出率为33.7％(68/202),转移率为11.8％(8/68),8例IMSLN转移患者,术后淋巴结分期发生了改变,其中1例患者不伴腋窝淋巴结(axillary lymph node,ALN)转移(pN0至pN1b),2例伴1～3枚ALN转移(pN1a至pN1c),4例伴4～9枚ALN转移(pN2a至pN3b),1例伴≥10枚ALN转移(pN3a至pN3b),术后病理学分期也发生了改变(0期至ⅠB期,ⅡA/ⅢA期至ⅢC期),这8例IMSLN转移患者术后均接受了内乳区放疗(internal mammary node irradiation,IMNI).结论:NAC后IMSLN有显像的患者,尤其是cN+患者,NAC后应接受IMSLNB,以期获得完整的淋巴结分期.IMSLNB能够进一步完善淋巴结病理完全缓解的定义并指导IMNI.
关键词： 乳腺肿瘤 新辅助化疗 内乳区前哨淋巴结活检 新型注射技术 -
一种结肠癌干细胞上皮-间质转化分层模型的建立和验证
背景与目的:肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)是肿瘤中具有干细胞特性的一类细胞,同时具有自我更新能力及多向分化潜能.CSC在肿瘤转移过程中起着重要作用.上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与恶性肿瘤浸润、转移及与肿瘤患者预后紧密联系.本研究以CSC是否经EMT为标准,建立一种新型结肠癌干细胞EMT分层模型,以评价不同活性物质对不同分型的结肠癌干细胞表型的影响.并用当下研究成熟的抑癌基因miR-139-5p及其靶向抑制的转录因子4(transcription factor 4,TCF4)蛋白验证上述模型的可行性,为临床研究提供理论依据.方法:以CD44和细胞上皮黏附分子/上皮特异性抗原(epithelial cell adhesion molecule/epithelial specific antigen,EpCAM/ESA)为结肠癌干细胞标志物,采用流式细胞术分选皮下移植瘤中CD44+ESA+、CD44+ESA-细胞亚群和转移瘤中CD44+ESA+、CD44+ESA-细胞亚群,分别命名为Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P,亲本细胞株HCT116作为后续实验的阴性对照;验证分选后不同细胞亚群的多药耐药性、克隆形成能力以及干性转录因子SOX2、OCT4和EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达情况;检测miR-139-5p过表达、TCF4敲低对Epi-P和pEMT-P以及TCF4过表达对Epi-S和pEMT-S CSC侵袭能力与EMT标志分子E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白的影响.结果:相较于HCT116亲本细胞株,Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P共4种CSC分型均对奥沙利铂(oxaliplatin,LOHP)和氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)产生了不同程度的抗性;干性相关转录因子OCT4和SOX2在4种CSC分型中表达均升高,与亲本细胞株相比,差异有统计学意义(P<0.05);上皮相关标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin在4种CSC分型中表达均升高,与亲本细胞株相比,差异有统计学意义(P<0.05);过表达miR-139-5p或敲低TCF4均能抑制Epi-P和pEMT-P结肠癌干细胞亚型的侵袭能力(P<0.01);在表型稳定未经历EMT的上皮亚系Epi-S中,过表达TCF4能够显著促进其侵袭能力(P<0.01);Epi-P和pEMT-P中过表达miR-139-5p和敲低TCF4,上皮标志物E-cadherin表达增加,间充质标志物N-cadherin和vimentin表达下降.结论:以CD44和ESA为结肠癌干细胞标志物分选出的4种分型具有不同表型可塑性,该模型可用来评价不同生物活性物质对结肠癌干细胞上皮-间质转化的影响.
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血清HER2-ECD水平在乳腺癌新辅助化疗中的应用价值分析
背景与目的:人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)是一种原癌基因所表达的蛋白,HER2阳性往往预示着肿瘤进展快、容易发生淋巴结或血道转移,对新辅助化疗不敏感,预后不佳.本研究通过对乳腺癌患者血清HER2胞外段(extracellular domain,ECD)水平与患者临床新辅助化疗的反应性的比较,来评估血清HER2-ECD在新辅助化疗评估中的价值.方法:收集507例乳腺癌患者的治疗前血清样本,利用χ2检验比较血清HER2-ECD与患者年龄、分期、组织雌激素受体、孕激素受体、Ki-67及HER2的关系,对其中48例HER2表达阳性的行新辅助化疗的乳腺癌患者予以随访,单因素分析治疗前后血清HER2-ECD水平变化与新辅助化疗疗效之间的关系.结果:通过对507例患者血清HER2-ECD和临床病理特征的比较发现,在年龄>50岁、Ⅲ～Ⅳ期、组织雌激素受体(-)、孕激素受体(-)、Ki-67>20％及HER2(+)的患者中血清HER2-ECD阳性率较高.对48例组织HER2阳性的患者随访发现,血清HER2-ECD在治疗2个周期后即出现大幅下降,从18.10 ng/mL(13.20～28.95 ng/mL)降低到11.20 ng/mL(9.80～12.75 ng/mL)(P<0.01).对48例患者进行疗效评估发现,新辅助化疗2个周期后血清HER2-ECD阴性的患者其客观缓解率(94.7％,36/38)显著高于治疗后血清HER2-ECD阳性的患者(60.0％,6/10)(P<0.05).结论:乳腺癌患者血清HER2-ECD升高与其年龄、分期、组织雌激素受体、孕激素受体及Ki-67相关,且新辅助化疗2个周期后的血清HER2-ECD水平对新辅助化疗的疗效有一定的评估作用.
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AJCC第7版与第8版分期对乳腺癌患者预后预测的比较分析
背景与目的:美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版乳腺癌分期在传统解剖因素基础上,结合生物标志物,建立了一种全新的乳腺癌预后分期系统.该研究旨在分析AJCC第8版乳腺癌分期的临床应用价值.方法:分析222例乳腺癌根治术后出现复发转移的患者,按照AJCC第7版解剖分期:肿瘤(tumor,T)分期、淋巴结(node,N)分期、转移(metastasis,M)分期,和第8版预后分期标准进行初诊状态再分期,比较不同标准分期的差异及与预后的关系,生存分析采用Kaplan-Meier方法,log-rank法检验无病生存期(disease-free survival,DFS)的差异.结果:按照AJCC第7版分期标准,ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB和ⅢC期的患者分别为34例(15.3％)、0例(0.0％)、73例(32.9％)、26例(11.7％)、45例(20.3％)、4例(1.8％)和40例(18.0％);按照AJCC第8版预后分期标准,ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB和ⅢC期的患者分别为47例(21.2％)、35例(15.8％)、55例(24.8％)、17例(7.7％)、25例(11.3％)、30例(13.5％)和13例(5.9％),差异有统计学意义(P=0.000).分期变化主要有:第7版Ⅰ期细分为第8版ⅠA和ⅠB期;第7版ⅡA期细分为第8版ⅠA、ⅠB和ⅡA期;第7版ⅡB期细分为第8版ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB和ⅢA期;第7版ⅢA期细分为第8版ⅠB、ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB和ⅢC期;第7版ⅢB和ⅢC期细分为第8版ⅢA、ⅢB和Ⅲc期.AJCC第7版TNM分期和第8版预后分期与患者DFS比较差异均有统计学意义(P=0.002和0.001),第8版预后分期ⅢB和ⅢC期亚组的DFS更为准确.结论:AJCC第8版预后分期能够准确预测乳腺癌患者的预后.
