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铁超载对大鼠肝星状细胞的影响

张颖

摘要: 目的:研究铁超载对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响以初步证实铁超载对肝纤维化的促进作用。方法:大鼠肝星状细胞HSC-T6给予硫酸亚铁2μmol/L负载24 h,正常对照组给予DMSO 2μmol/L。免疫荧光染色法观察铁在HSC-T6中的分布面积,流式细胞术检测HSC-T6增殖, TUNEL法检测HSC-T6凋亡,Western blot检测HSC-T6基质金属蛋白酶1(MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,铁超载组HSC-T6内铁染色阳性的平均面积为39.02%±2.03%,平均增殖率为61.02%±2.21%,平均凋亡率为13.01%±0.95%,MMP-1和TIMP-1的蛋白平均表达水平分别增加了38.82%±7.62%和179.88%±17.52%。结论:铁超载导致肝星状细胞的增殖率大于其凋亡率,并且肝星状细胞基质金属蛋白酶抑制剂的表达水平高于其基质金属蛋白酶的水平,因此推断铁超载促进了肝星状细胞的活性,从而促进了肝纤维化的进程。

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  • 精氨酸加压素对大鼠视前区GABAA受体 亚单位磷酸化的影响

    作者:唐瑜;孙士林;尹双双;彭哲宇;曾宪刚;姚姝婷;何钰婷;彭娜

    目的:研究精氨酸加压素(AVP)对大鼠视前区γ-氨基丁酸(GABA)A型受体(GABAA受体)亚单位(α、β和γ2)表达和磷酸化的影响.方法:实验分为对照组、AVP组、V1a受体抑制剂+AVP组和V1a受体抑制剂组(均n=10);腹腔注射AVP或V1a受体抑制剂0.5 h后,采用RT-qPCR和Western blot法检测视前区GABAA受体亚单位(α、β和γ2)表达及磷酸化的变化.结果:与对照组相比,AVP或V1a受体抑制剂组大鼠视前区GABAA受体亚单位表达均无显著变化;AVP能显著上调视前区GABAA受体γ2亚单位的磷酸化水平(P<0.05);AVP显著增加蛋白激酶C(PKC)和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达和磷酸化(P<0.01).结论:外源性AVP不影响GABAA受体亚单位(α、β和γ2)表达,但主要通过V1a受体激活PKC和CaMKⅡ,影响γ2亚单位磷酸化水平,从而调制视前区GABAA受体介导的抑制性突触传递.

  • 绿原酸改善db/db小鼠血管内皮功能障碍的作用初探

    作者:杨艳秋;刘森;王丹;刘家欣;李文章;王沛坚

    目的:探讨绿原酸(CGA)对肥胖型2型糖尿病小鼠血管内皮功能障碍的作用并初步分析相关的机制.方法:雄性db/db小鼠12只,随机分对照组和CGA组,每组6只.CGA组以含0.02%CGA的饲料喂养,对照组给予普通饲料喂养,干预时间为12周.每周测空腹血糖、体重和鼠尾血压.实验结束后取血分离血浆,采用ELISA法测血红素氧合酶1(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)、醌NAD(P)H脱氢酶1(NQO1)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx-1)的水平.取胸主动脉以DHE和DAF-2 DA染色观察血管内膜超氧阴离子和一氧化氮(NO)水平,以Wire Myograph System观察胸主动脉张力,Western blot观察血管组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、磷酸化AMP活化蛋白激酶(p-AMPK)、磷酸化内皮型NO合酶(p-eNOS)、P22phox和P47phox的蛋白水平.结果:膳食CGA可显著降低小鼠的空腹血糖和体重,增加血浆中HO-1、CAT、NQO1和GPx-1水平,减少血管内皮超氧阴离子的水平,增加NO水平,改善小鼠血管内皮依赖性舒张功能(P<0.01).Western blot结果发现CGA可显著上调血管组织中PPARα、Nrf2、p-AMPK和p-eNOS的蛋白水平,降低P22 phox和P47 phox的水平(P<0.01).结论:膳食CGA显著改善db/db小鼠血管内皮依赖性舒张功能.这可能与其上调PPARα、Nrf2和AMPK等抗氧化应激分子,降低氧化应激水平,促进eNOS磷酸化有关,但确切机制尚需进一步研究.

  • HSF1基因缺失通过上调microRNA-195 a-3 p加速压力超负荷下心脏重构

    作者:王时俊;徐磊;赵刚;杨继娥;马雷雷;崔兆强;邹云增;葛均波

    目的:探讨热休克转录因子1(HSF1)调控微小RNA-195a-3p(miR-195a-3p)对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响,旨在阐明HSF1基因缺失加重压力超负荷下心脏重构的病理分子机制.方法:压力超负荷动物模型采用小鼠主动脉弓缩窄(TAC),辅以心脏超声功能评价.在体实验分组为HSF1基因敲除(HSF1-/-)小鼠假手术组、C57BL/6野生型(WT)小鼠假手术组、HSF1-/-小鼠TAC模型组和C57BL/6 WT小鼠TAC组;细胞实验分组为对照组、miR-195a-3p模拟物干预组和阴性对照microRNA(miR-NC)干预组.TAC术后4周,通过病理组织切片检测各组小鼠心肌肥厚(HE染色)和血管新生(CD31染色),小鼠心超检查心脏主要功能指标变化;通过生物信息软件TargetScan 6.2结合萤光素酶(luciferase)报告基因检测,以及Western blot验证,测定miR-195a-3p调控血管新生的下游分子靶点;并用miR-195a-3p诱导微血管内皮细胞,观察其对细胞成管能力的影响.结果:HSF1缺失会导致TAC诱导的小鼠左心室重构加重.芯片筛查结果表明HSF1缺失可促进心脏12种microRNAs表达上调,5种microRNAs在心肌微血管内皮细胞中表达显著升高,其中miR-195a-3p的增高具有统计学显著性.miR-195a-3p过表达可以有效抑制微血管内皮细胞CD31和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,阻滞细胞形成管腔样结构.TargetScan 6.2预测miR-195a-3p的靶点为AMP活化蛋白激酶α2(AMPKα2),在微血管内皮细胞用miR-195a-3p模拟物干预可以有效抑制AMPKα2的表达,同时miR-195a-3p模拟物也抑制了CD31和VEGF的表达.结论:HSF1基因缺失导致的miR-195a-3p表达上调是加速压力超负荷下心脏重构的重要诱因,其机制可能是通过抑制AMPKα2介导的血管新生信号通路的激活.

  • 自噬在乙二醇诱导的大鼠肾内晶体形成中的调控作用

    作者:李德荣;刘云龙;王翔;孙焱;康珏宁;刘权;何子奇;陶芝伟;关晓峰;邓耀良

    目的:探讨自噬在乙二醇诱导的大鼠肾内晶体形成中的调控作用.方法:健康雄性SPF级SD大鼠40只,分为正常对照组、结石模型组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理组(0.75%乙二醇+NAC)、雷帕霉素处理组(0.75%乙二醇+雷帕霉素)和氯喹处理组(0.75%乙二醇+氯喹),每组8只.干预4周后,应用Western blot和免疫组化检测各组肾脏组织中自噬关键蛋白LC3-Ⅱ的表达水平;透射电镜观察各组肾组织中自噬泡的数量;应用试剂盒检测各组24 h尿液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平;全自动生化仪检测各组血清肌酐及尿素氮的水平;ELISA法检测各组24 h尿液中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子1(Kim-1)的水平.钙盐染色法观测各组肾脏晶体的沉积情况,评价肾组织的病理学变化.结果:与结石模型组相比,雷帕霉素处理组和氯喹处理组中LC3-II的表达水平和自噬泡数量均增加,而在NAC处理组中LC3-II的表达水平和自噬泡数量均减少(P<0.05).与结石组相比,雷帕霉素处理组中T-SOD和GSH-Px水平降低,而氯喹处理组和NAC处理组中T-SOD和GSH-Px的活性增加(P<0.05).与正常组相比,结石组中血清肌酐、尿素氮、NGAL和Kim-1的水平及肾脏内晶体沉积增加(P<0.05);在雷帕霉素处理组中肾脏损伤进一步加重,晶体沉积进一步增加,而在氯喹处理组和NAC处理组中肾脏损伤明显减轻,晶体的沉积明显减少.结论:乙二醇激活自噬后可以促进大鼠肾内晶体的形成.应用抗氧化剂和自噬抑制剂不仅可以降低肾脏内的自噬水平,还可以减轻肾脏损伤,减少晶体沉积,降低肾结石的形成率.

  • FAM3 C通过激活Akt促进口腔鳞癌细胞活力

    作者:迟毓婧;李玫;禹祎萌;刘爱禹;郁卫东;莫珩

    目的:探讨FAM3C(family with sequence similarity 3,member C)蛋白在口腔鳞癌细胞中的表达和作用.方法:通过RT-qPCR及Western blot法检测人口腔鳞癌癌前病变细胞DOK和口腔鳞癌细胞WSU-HN6中FAM3C的mRNA及蛋白表达水平.在WSU-HN6细胞中分别使用siFAM3C和抗FAM3C抗体处理,在DOK细胞中使用腺病毒过表达FAM3C,分别在处理后24、48和72 h使用CCK-8和Western blot法检测FAM3C对细胞活力及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)激活的影响.结果:(1)与DOK细胞相比,WSU-HN6细胞中FAM3C的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);(2)siFAM3C在转染后48 h和72 h均可抑制WSU-HN6细胞的活力(P<0.05),同时抑制Akt的激活(P<0.05);(3)抗体封闭FAM3C蛋白48 h和72 h也能抑制WSU-HN6细胞的活力,并抑制Akt的激活(P<0.05);(4)过表达FAM3C 48 h和72 h可促进DOK细胞的活力,并激活Akt(P<0.05).结论:FAM3C可能通过激活Akt促进口腔鳞癌细胞的活力.

  • VEGF基因转染脂肪干细胞后上清液对皮肤成纤维细胞及脐静脉血管内皮细胞的影响

    作者:李江璇;肖丽玲;李升红;刘宏伟;潘潇寒;张碧雅

    目的:通过慢病毒将血管内皮生长因子(VEGF)基因转染于人脂肪干细胞(HADSCs),检测其上清液(CM)中生长因子的表达,并用其上清液作用于人皮肤成纤维细胞(HDFs)及人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察对这2种细胞活力和迁移的影响.方法:准备HADSCs、HDFs及HUVECs 3种细胞并鉴定;将携带VEGF165基因的慢病毒转染于HADSCs,定时收集上清液;ELISA法检验上清中生长因子分泌情况;将VEGF-CM与完全培养液以一定比例混合分为5组,分别培养HDFs及HUVECs,CCK-8法检验对2种细胞活力的影响;将佳比例的VEGF-CM、正常CM(Nor-CM)和完全培养液分别作用于HDFs及HUVECs,划痕法测试出对2种细胞迁移的影响.结果:ELISA结果表明VEGF-CM中VEGF及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达均较Nor-CM组提高;相对于其它比例,当完全培养液与VEGF-CM以1:2的比例混合时,HDFs和HUVECs的活力显著增强(P<0.05);VEGF-CM与其它培养液相比可显著提高HDFs和HUVECs的迁移能力(P<0.05).结论:转染VEGF165基因后的HADSCs可同时增强VEGF及bFGF的分泌,其上清液可提高成纤维细胞及血管内皮细胞的活力和迁移能力.

  • Notch1/Hes1信号调控C/EBPα表达对AECII细胞增殖与分化的影响

    作者:万峰云;卢红艳;万雪晴;朱玥;郝晓波

    目的:探讨Notch1/Hes1信号通路能否通过调控CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的表达从而影响肺泡II型上皮细胞(AECII)的增殖与分化功能.方法:体外培养人AECII,将细胞随机分为对照组、激活剂组(加入Notch通路激活剂Jagged1蛋白500μg/L)和抑制剂组(加入Notch通路抑制剂DAPT 10μmol/L),于干预后24 h收获各组细胞.采用RT-qPCR和Western blot法分别检测Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA与蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞活力;细胞计数检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期及分化.结果:与对照组相比,激活剂组Notch1、Hes1和C/EBPα的mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.05),促进AECII从S期进入G2/M期,增殖增加而分化减少(P<0.05);抑制剂组Notch1、Hes1和C/EBPαmRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05),AECII被阻滞于G0/G1期,增殖减少而分化增加(P<0.05).结论:Notch1/Hes1信号可调控C/EBPα表达并能影响AECII增殖与分化.

  • 慢性束缚应激大鼠下丘脑弓状核食欲 调控因子的变化

    作者:王霞;王少贤;方朝义;王杰鹏;旷湘楠;赵丹;王一旭

    目的:观察慢性束缚应激大鼠血清中瘦素(leptin)及下丘脑弓状核(arcuate nucleus,ARC)中瘦素受体(leptin receptor,LEPR)、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)、刺鼠相关蛋白(agouti-related protein,AgRP)、阿黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)和可卡因苯丙胺调节转录物(cocaine amphetamine-regulated transcript,CART)的表达变化,探讨慢性束缚应激大鼠出现摄食减少和体重减轻等表现的中枢机制.方法:90只SD健康雄性大鼠随机分为空白对照(BC)组、7 d应激(7-S)组和21 d应激(21-S)组.7-S组和21-S组大鼠每天接受连续3 h束缚应激,分别持续7 d和21 d;BC组正常饲养21 d,不予应激干预.观察各组大鼠摄食量和体重变化,ELISA方法测定血清中leptin和下丘脑ARC中LEPR含量;Western blot和RT-qPCR法分别检测下丘脑ARC中LEPR、NPY、AgRP、POMC和CART的蛋白和mRNA表达水平;并用Pearson相关系数法探究21-S组大鼠体重/摄食量变化与ARC中上述食欲因子mRNA表达的关系.结果:与同一时点BC组相比,7-S组和21-S组大鼠的摄食量减少,体重增长延缓.7-S组和21-S组大鼠血清leptin水平,以及ARC中LEPR、POMC和CART的蛋白和mRNA表达较BC组有不同程度升高(P<0.05),而NPY和AgRP的蛋白和mRNA表达则显著降低(P<0.05),且21-S组变化为明显.Pearson相关分析表明,21-S组大鼠体重与其ARC中LEPR和CART的mRNA表达呈显著负相关(P<0.05或P<0.01),与NPY的mRNA呈显著正相关(P<0.05);摄食量与POMC的mRNA表达呈显著负相关(P<0.05);体重与摄食量的相关性分析无统计学显著性.结论:慢性束缚应激大鼠下丘脑ARC内部食欲因子表达与其体重/摄食变化存在一定关联性,但其作用机制有待进一步探讨.

  • 柚皮苷对人肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞的逆转作用

    作者:崔美英;贺红柳;李盼;毛颖

    目的:探究柚皮苷(naringin,NRG)对人肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其可能的分子机制.方法:采用CCK-8法检测柚皮苷和顺铂对A549/DDP细胞的毒性作用,采用Chou-Talalay中效分析法对两药的联合效应进行评价;采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用Western blot法检测P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)、p-Akt、CXC趋化因子受体4(CXC chemokine re-ceptor 4,CXCR4)、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平.结果:顺铂耐药株A549/DDP细胞中P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白的水平显著高于非顺铂耐药株A549细胞(P<0.05);柚皮苷和顺铂可剂量依赖性地抑制A549/DDP细胞活力(P<0.05),IC50分别为36.92μmol/L和129.77μmol/L;当抑制率超过15%时,二者联用呈协同效应;柚皮苷与顺铂可诱导A549/DDP细胞凋亡(P<0.05),并且两药联用组的细胞凋亡率高于顺铂组(P<0.05);柚皮苷和顺铂可上调Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05),下调Bcl-2的蛋白水平(P<0.05),同时柚皮苷还可剂量依赖性地下调P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4的蛋白水平(P<0.05).结论:柚皮苷可增强人肺癌A549/DDP细胞对顺铂的敏感性.这可能与柚皮苷上调Bax的蛋白水平,下调Bcl-2、P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4的蛋白水平有关.

  • 上调miR-181a抑制香烟提取物诱导的支气管上皮细胞致炎因子生成与collagen IV、fibronectin和α-SMA表达

    作者:梁珍珍;解玉东;张艳莉;韩丽丽;吕燕平

    目的:探讨微小RNA-181a(miR-181a)对香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)致炎因子生成与IV型胶原蛋白(collagen IV)、纤连蛋白(fibrone-ctin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,并分析其可能的机制.方法:RT-qPCR检测CSE诱导下HBECs中miR-181a的表达情况.转染miR-181a mimic后经ELISA检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的水平;Western blot检测collagen IV、fibronectin和α-SMA的表达;并进一步评估NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路的活性.结果:CSE可显著增加HBECs中致炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的生成,显著上调collagen IV、fibronectin和α-SMA的表达,同时细胞内miR-181a的表达明显降低(P<0.05);转染miR-181a mimic可显著抑制CSE诱导的HBECs致炎因子生成及collagen IV、fibronectin和α-SMA表达(P<0.05).此外,Western blot的结果显示转染miR-181a mimic可抑制CSE诱导的NF-κB/TGF-β1/Smad3信号活性(P<0.05).结论:上调miR-181a表达可部分逆转CSE诱导的HBECs致炎因子的释放及collagen IV、fibronectin和α-SMA表达,其作用机制可能与抑制NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路的活化有关.

中国病理生理

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