电刺激孤束核对大鼠心脏伤害性感受的作用及其脊髓机制的探讨
摘要： 目的 观察电刺激孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)对心包内注射辣椒素诱发的心脏-躯体运动反射(cardiac-somatic motor reflex,CMR)的影响,以及脊髓鞘内注射受体拮抗剂对NTS这一电刺激效应的影响,探讨参与NTS对心脏伤害性信息调控的脊髓机制.方法 SD大鼠随机分为电刺激组、对照组、育亨宾组、纳洛酮组.分别单独电刺激NTS或电刺激NTS结合脊髓鞘内注射溶媒、生理盐水、去甲肾上腺素α2受体阻断剂(育亨宾)或阿片受体阻断剂(纳洛酮),观察以背斜方肌肌电(electromyogram,EMG)活动为指标的CMR变化.结果 与对照比较,电刺激(10、20、50μA)NTS,CMR呈强度依赖性的减少(P＜0.05);鞘内注射育亨宾的溶媒或生理盐水10 μL,对20 μA电刺激的抑制效应没有明显影响(P＞0.05);鞘内注射育亨宾(20、50μg)或纳洛酮(50、100 μg),电刺激对CMR的抑制效应被翻转(P＜0.05);鞘内注射小剂量的纳洛酮(10μg),使电刺激对CMR的抑制效应增强(P＜0.05).结论 电刺激NTS对心脏伤害性感受信息有下行抑制作用,脊髓的α2去甲肾上腺素受体和阿片受体介导NTS的下行抑制作用,小剂量的纳洛酮对该下行抑制有协同作用.
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消退素RvD1减轻雨蛙素联合LPS诱导的小鼠重症急性胰腺炎的实验研究
目的 探讨消退素(RvD1)对雨蛙素联合脂多糖(LPS)诱导的小鼠重症急性胰腺炎(SAP)的治疗作用.方法 雨蛙素联合LPS诱导小鼠重症急性胰腺炎模型,并设立生理盐水对照组.建模4h后,对小鼠一次性腹腔注射RvD1(150 mg/kg)进行干预处理,所有小鼠在开始造模24 h后取血,处死小鼠取胰腺标本,HE染色观察病理改变及评分;ELISA检测小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平,液相芯片检测小鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)质量浓度.结果 雨蛙素联合LPS成功诱导小鼠SAP模型(胰腺组织炎症性改变,病理评分增加,淀粉酶、脂肪酶升高);RvD1干预明显减轻SAP组小鼠胰腺病理改变,降低淀粉酶、脂肪酶的水平,降低血清TNF-α、IL-6质量浓度.结论 RvD1能够减轻雨蛙素联合LPS诱导的小鼠SAP炎症程度.
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microRNA启动子区甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响
目的 研究microRNA启动子区甲基化水平的变化对几种microRNAs (miRNA34a、miRNA34b、miRNA148a、miRNA203a)表达的影响,并进一步研究该甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移以及侵袭能力的影响.方法 不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理人肺癌细胞A549,分别作用24 h、48 h、72 h,采用CCK8法检测细胞增殖情况,计算增殖抑制率.20 μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞72 h,通过甲基化特异性PCR(MSP)检测A549细胞相关miRNAs启动子甲基化水平的变化;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测A549细胞相关miRNAs表达水平的变化.20μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞0h、24 h、48 h,采用划痕实验检测细胞迁移能力(计算细胞在24 h和48 h的划痕愈合率);作用48 h,采用Transwell检测细胞侵袭能力.结果 CCK8结果显示,随着5-Aza-CdR的处理浓度升高、时间延长,A549细胞的增殖抑制率逐渐增加.经5-Aza-CdR去甲基化处理后,MSP结果表明,实验组相对于对照组甲基化引物扩增条带减弱,而非甲基化引物扩增条带增强;Real-time PCR结果显示,相关miRNAs表达水平升高(P＜0.05).由划痕实验和Transwell检测结果揭示,经5-Aza-CdR处理后,A549细胞的生长愈合能力降低(P＜0.05),并且侵袭到Transwell小室滤膜下表面的细胞数亦减少(P＜0.05).结论 人肺癌细胞A549经5-Aza-CdR去甲基化处理后,miRNAs表达水平升高,进一步抑制肺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力.
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年龄增加对人血管内皮依赖性舒张作用的实验研究及机制探讨
目的 探讨年龄增加对人血管内皮依赖性舒张作用的影响及其初步机制.方法 采用血管环张力测定法,在15例不同年龄段(51～83岁)胃癌患者手术切除的胃网膜动脉上,测定0.001～10 μmol/L乙酰胆碱(ACh)诱发的血管内皮依赖性舒张作用和内皮依赖性超级化因子(EDHF)样血管舒张作用的变化;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法观察不同年龄人血管中的内皮型NO合酶(eNOS)、环氧合酶(COX)、胱硫醚γ裂解酶(CSE)以及C-型利钠肽(CNP)基因表达的改变.结果 相同剂量下,ACh诱导出人动脉内皮依赖性的舒张作用会随着年龄的增加而减弱(P＜0.05),其EDHF样血管舒张作用也明显降低(P＜0.05);qRT-PCR发现随着年龄的增加,其血管eNOS、CSE和CNP mRNA表达降低(P＜0.05),而COX mRNA表达的年龄趋势不明显.结论 随年龄的增加,血管内皮依赖性舒张和EDHF样舒张作用降低,可能与内皮合成的NO和CNP等舒血管物质减少有关.
关键词： 年龄 血管内皮依赖性舒张 内皮依赖性超级化因子 内皮细胞 人动脉 -
靶向ROR1的嵌合抗原受体修饰T细胞的构建及对ROR1阳性肿瘤细胞的杀伤作用
目的 探讨靶向Ⅰ型受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR1)的嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)治疗ROR1阳性肿瘤细胞的体外杀伤作用.方法 设计并合成CAR基因,通过慢病毒载体质粒pWPXLd,构建靶向ROR1的CAR-T核心质粒,采用BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定,应用流式细胞术检测多种实体瘤癌细胞株表面ROR1的表达,并采用流式细胞术、乳酸脱氢酶(LDH)检测试验检测CAR-T对ROR1阳性肿瘤细胞的杀伤作用,ELISA检测试剂盒测定培养细胞上清中γ-干扰素(IFN-γ)含量.结果 构建的CAR-T质粒双酶切鉴定有CAR基因插入,流式细胞术检测结果显示CAR-T感染效率约为47.23％.多种肿瘤细胞不同程度表达ROR1.流式细胞术、LDH检测试验结果提示CAR-T能特异性地杀伤ROR1阳性肿瘤细胞.CAR-T针对ROR1阳性靶细胞能释放更多的IFN-γ(P＜0.05).结论 成功构建靶向ROR1的CAR-T,并能特异地杀伤ROR1阳性肿瘤细胞,释放大量IFN-γ,为临床应用提供了实验基础.
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干扰UCA1及抑制miR-185-5p对非小细胞肺癌β-Catenin通路的活化、自噬和存活影响
目的 探究在非小细胞肺癌中,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)尿路上皮癌抗原1(urothelial carcinoma associated 1,UCA1)敲降miR-185-5p对β-Catenin通路的影响.方法 选取非小细胞肺癌A549细胞为研究材料,设置A549空白对照组、sh-scramble阴性对照组、sh-UCA1干扰组、miR-185 inhibitor组和sh-UCA1+inhibitor组.Western blot验证体系中增殖、凋亡和自噬相关分子表达;qRT-PCR鉴定体系中lncRNAUCA1和miR-185-5p的表达;生物信息学软件和荧光素酶实验检测lncRNA UCA1和miR-185-5p之间结合性.BrdU染色鉴定细胞增殖,免疫荧光染色检测细胞中LC3+细胞含量.结果 在A549细胞中,lncRNA UCA1干扰后,UCA1表达量显著下降并促进miR-185-5p表达,有效抑制肺癌细胞增殖和自噬,促进凋亡发生(P＜0.01);经生物信息学和双荧光素酶报告系统验证lncRNA UCA1和miR-185-5p有较强结合性;并进一步验证lncRNAUCA1可以有效抑制β-Catenin/TCF-4及Beclin 1和LC3Ⅱ表达,降低miR-185-5p对肺癌细胞增殖和自噬效果,减少细胞内LC3含量(P＜0.01).结论 lncRNA UCA1干扰后,可以有效降低UCA1对miR-185-5p的抑制效果,进而解除β-Catenin/TCF-4、Beclin 1和LC3Ⅱ受到的抑制作用,从而减少肺癌细胞自噬发生和减缓增殖.
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缺氧诱导因子-1α对肺癌脑转移的作用及其机制的研究
目的 探讨缺氧与肺癌细胞释放缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的关系,揭示肺癌脑转移的可能机制.方法 建立A549肺癌细胞缺氧模型,缺氧培养A549细胞0.5、2、4、8、12和24 h(设同时点常氧培养为对照组)后,ELISA法测定A549细胞培养液内HIF-1α质量浓度.Transwell小室构建体外血脑屏障模型,A549细胞培养液缺氧不同时间后,检测体外血脑屏障模型的跨内皮阻抗(TER)变化,以反映体外血脑屏障通透性的改变;计数Transwell下室培养液中的A549细胞数.将缺氧不同时间的A549细胞培养液经尾静脉注入Wistar大鼠,伊文思兰检测动物血脑屏障通透性改变;Western blot法测定紧密连接相关蛋白Claudin-5在大鼠脑组织中的表达变化.结果 与对照组比较,A549细胞缺氧培养2h后,其细胞培养液内HIF-1α质量浓度增高,体外血脑屏障模型TER减小,穿过Transwell进入下室的缺氧A549细胞数增多(P均＜0.05),以缺氧8h时上述作用明显(P＜0.01),24 h恢复至对照组水平.在大鼠体内实验中,与同时点对照组比较,尾静脉注入缺氧2h的A549细胞培养液后,大鼠脑组织中伊文思兰质量百分比增加,大鼠脑组织中Claudin-5蛋白表达降低(P均＜0.05),并且以注入缺氧8h的A549细胞培养液作用明显(P＜0.01),注入缺氧24 h的A549细胞培养液则与同时点对照组水平相当.结论 缺氧可引起肺癌细胞释放HIF-1α增多.增多的HIF-1α导致血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5表达减少,血脑屏障通透性增大,肺癌细胞转移入脑.
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ILO与LLO协助李斯特菌黏附、侵袭细胞及胞内增殖的比较研究
目的 研究李斯特菌溶血素的主要功能,比较两种李斯特菌——绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,LI)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的溶血素对细菌黏附细胞等作用的强弱.方法 构建含有LIi-hly基因上、下游同源序列和lacZ基因或hly基因的打靶质粒,利用基因重组技术构建LI溶血素(ILO)缺陷的LI重组菌株LI△i-hly∷lacZ和回补表达LM溶血素(LLO)的重组菌株LI△i-hly∷hly;比较2株重组菌与野生LI对人肝癌HepG2细胞的黏附、侵袭能力;比较3株菌在巨噬细胞RAW264.7内的增殖能力.结果 重组菌株LI△i-hly∷lacZ和LI△i-hly∷hly的基因序列与预期相符;LI△i-hly∷hly、LI和LI△i-hly∷lacZ对HepG2细胞的黏附率分别为(3.43±0.82)％、(3.43±1.59)％和(3.41±1.12)％,侵袭率分别为(1.74±0.46)％、(1.22±0.75)％和(1.39±0.46)％,差异均无统计学意义;胞内增殖实验结果表明,与野生株相比,ILO缺陷株LI△i-hly∷lacZ在巨噬细胞内的增殖量降低,LI△i-hly∷hly的增殖量升高.结论 LI在细胞内的增殖水平与ILO有关,ILO缺失抑制了LI在细胞内的增殖能力,LM溶血素LLO协助细菌逃离吞噬泡进入宿主细胞质的能力强于LI溶血素ILO.
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针刺足三里对COPD大鼠血浆多巴胺和肺功能的影响
目的 观察针刺足三里对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠的血浆多巴胺、炎症因子、肺功能及肺组织形态学的影响,探讨多巴胺在针刺调控COPD慢性炎症机制中的作用.方法 32只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、假针刺组、针刺组(n=8).后3组大鼠采用香烟烟熏和脂多糖复合法诱导8周制备COPD模型.自第7周起,烟熏前针刺组电针大鼠双侧足三里穴(ST 36)、假针刺组电针双侧足部非穴位处,30 min/次,1天1次,连续2周;正常对照组和模型组大鼠不做电针治疗.比较治疗后各组大鼠血浆多巴胺及炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β、6、8(IL-1β、IL-6、IL-8)]质量浓度,进行肺功能[肺容积(TLC)、功能残气量(FRC)、第50微秒及100微秒用力呼气量与用力肺活量之比(FEV50/FVC,FEV100/FVC)、总气道阻力(RL)和肺动态顺应性(Cdyn)]、肺泡总面积与肺组织面积之比(A/t)及肺泡灌洗液(BALF)内细胞数比较,并将上述指标进行Pearson相关分析.结果 针刺组炎症因子、肺功能、A/t及BALF内细胞数均有不同程度改善,而血浆多巴胺质量浓度高于其它组.与模型组相比,针刺组TNF-α和IL-1β质量浓度、A/t及BALF内细胞数、肺功能(FEV50/FVC,FEV100/FVC,RL,Cdyn)的差异有统计学意义(P＜0.05),且针刺组优于假针刺组.Pearson相关分析表明:肺功能FRC、RL、Cdyn与炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及A/t均有关(P＜0.001),而TLC与炎症因子IL-8、IL-Iβ及A/t存在相关性(P＜0.05);多巴胺质量浓度与肺功能的FRC、TLC、FEV50/FVC,FEV100/FVC呈负相关(P＜0.05).结论 针刺能够缓解COPD大鼠炎症状态,改善肺功能,提高血浆多巴胺水平,且针刺对COPD大鼠肺功能的影响可能与降低炎症因子及提高多巴胺水平相关.
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地塞米松对阿霉素诱导的肾小球足细胞活动力的影响
目的 探讨地塞米松(dexamethasone,Dex)改善阿霉素(adriamycin,ADR)诱导的肾小球足细胞活性的机制.方法 将体外培养的小鼠肾小球足细胞分为3组:ADR组,Dex预处理组(Dex+ ADR)和空白对照组.采用划痕实验、Transwell实验、异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)方法进行肾小球足细胞功能分析.另取SD雄性大鼠72只,随机分为ADR组(尾静脉注射ADR 7.5 mg/kg),Dex治疗组(ADR+ Dex,尾静脉注射ADR 7.5 mg/kg后24 h,再注射Dex 1 mg/kg)和对照组(尾静脉注射等量生理盐水),分别给药后7d、14d、21d和28 d收集24 h尿液,测定24 h尿蛋白.采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测nephrin表达变化.电镜下平均足突宽度(FWP)进行相关分析.结果 划痕实验和Transwell结果显示,与空白对照组相比,ADR诱导肾小球足细胞活性升高,而Dex预处理后,肾小球足细胞的活力明显下降,与ADR组的差异有统计学意义(P＜0.05).FITC-BSA结果显示,与空白对照组相比,ADR诱导肾病肾小球足细胞FITC-BSA滤过率升高(P＜0.05);与ADR组相比,Dex预处理组肾小球足细胞FITC-BSA滤过率降低(P＜0.05).实时荧光定量PCR和WesternBlot结果显示,与对照组大鼠比较,ADR诱导的肾病组肾小球足细胞nephrin表达升高(P＜0.05),而Dex预处理后,大鼠肾小球足细胞nephrin表达下调(P＜0.05).电镜下结果显示,ADR组大鼠FWP高于正常组(P＜0.01);与ADR组相比,Dex治疗组FWP降低(P＜0.01).与对照组相比,ADR注射14 d开始,大鼠24 h尿蛋白增多(P＜0.01),第28天达到峰值(P＜0.001).与ADR组相比,Dex治疗组大鼠第14、21和28天24 h尿蛋白下降(P＜0.001).结论 Dex下调nephrin表达,进而拮抗ADR诱导的体外肾小球足细胞活动力升高,参与缓解肾病大鼠的蛋白尿发生.
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hADMSCs影响TLR4-TRIF信号通路诱导小鼠小胶质细胞表型极化的实验研究
目的 研究人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADMSCs)对小胶质细胞表型极化的影响及机制.方法 取C57/BL6小鼠BV-2小胶质细胞,以hADMSCs+脂多糖(LPS)间接共培养,或以单纯LPS培养.倒置显微镜下观察细胞形态.CCK-8法检测小胶质细胞增殖能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小胶质细胞M1/M2表型标记物的影响,Western blot检测小胶质细胞Toll样受体4(TLR4)-β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路相关蛋白的表达.结果 与单纯LPS培养相比,hADMSCs加入后,小胶质细胞镜下形态相似,细胞增殖活性被抑制(P＜0.05),M1表型标记物的基因表达减少(P＜0.05),M2表型标记物的基因表达增加(P＜0.05),TRIF、TLR4、干扰素调节因子3(IRF3)和磷酸化IRF3(P-IRF3)蛋白的表达水平降低(P＜0.05).结论 hADMSCs可抑制脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞M1促炎表型的极化,从而诱导其向保护型M2表型极化,此作用可能与其对TLR4-TRIF信号通路活化的抑制有关.
