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两面针药材HPLC色谱指纹图谱分析与质量评价
目的 建立两面针药材季铵类生物碱的高效液相色谱指纹图谱检测方法,鉴别和评价不同部位及商品药材饮片的质量.方法 色谱柱:ZORBAX XDB-C8(4.6×150mm,5μm);流动相:A.3%冰醋酸-二乙胺(1000:7.8),B.甲醇,C.乙腈(非线性梯度洗脱);柱温:20℃;流速:0.8 mL·min-1;检测波长:250 nm、270nm.结果 两面针液相色谱主要由白屈菜红碱(Chelerythrine)、氯化两面针碱(Nitidine chloride)等21个色谱峰以其相对稳定的峰与峰的积分比值所提供的以生物碱为主体的成分分布信息组成,可更有效地分析和评价药材的质量.结论 指纹图谱显示生物碱主要分布在根皮部,故皮部脱落的商品老根饮片质量低劣;地上茎部生物碱分布很低,不宜与根部同等使用.
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两面针提取工艺研究
目的 优选两面针药材的佳提取工艺.方法 采用正交试验,以乙醇体积分数、乙醇用量、提取次数和提取时间作为优选因素,以出膏率和氯化两面针碱转移率为综合指标,确定合理的醇提取工艺.结果 佳提取工艺条件是:乙醇体积分数为70%,乙醇用量为8倍,提取4次,每次1.5 h.结论 优化得到的提取工艺稳定可行,为生产提供了实验依据.
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氯化两面针碱与G-四链体相互作用的光谱法研究
目的 研究氯化两面针碱与端粒G-四链体的相互作用.方法 采用圆二色(CD)光谱和荧光滴定法测试氯化两面针碱与人端粒DNA序列d[G3(T2AG3)3]的相互作用.结果与结论 CD光谱表明氯化两面针碱在体外能够诱导人端粒DNA序列d[G3(T2AG3)3]形成反平行G-四链体,并能提高G-四链体的热稳定性；荧光滴定实验表明化合物与G-四链体具有很好的亲和力.
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两面针中氯化两面针碱提取工艺优化
目的 考察不同pH值水溶液对氯化两面针碱的提取的影响.方法 采用正交实验法对提取溶液的pH、温度、加水量条件进行筛选,以氯化两面针碱的提取率作为指标,用HPLC法测定溶液中氯化两面针碱的含量.结果 氯化两面针碱的佳条件为适量的两面针流浸膏加入10倍量,40℃的水,调整酸度pH=1.0的溶液环境.结论 优选的氯化两面针碱提取条件适合工业大生产.
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氯化两面针碱对肝癌细胞蛋白表达谱的影响研究
目的 通过分析氯化两面针碱(NC)对体外培养肝癌细胞蛋白表达谱的影响,探讨其对肝癌细胞抑制的作用机制.方法 应用蛋白芯片飞行时间质谱技术测定NC作用前后肝癌细胞蛋白的表达谱,在蛋白质专家网站(ExPASy)上进行比对,采用单因素方差分析比较不同组中相同质荷比的蛋白质含量,对处理前后的质谱变化进行配对t检验分析.结果 采用NC处理人肝癌细胞SMMC-7721后,应用蛋白芯片飞行时间质谱技术共筛选出有统计学意义的差异表达蛋白质峰14个,这些差异蛋白主要跟细胞凋亡、细胞周期、信号转导、转录、DNA复制及修复、代谢、免疫等通路有关.结论 氯化两面针碱对肝癌细胞的抑制作用,可能是通过免疫、代谢等多条通路综合作用的结果.
关键词： 氯化两面针碱 肝癌细胞 SELDI-TOF-MS技术 蛋白表达谱 -
氯化两面针碱对KB及KBV200细胞周期的影响及其机制
目的:研究氯化两面针碱抑制人口腔鳞癌细胞KB及其耐药株KBV200增殖的作用及机制.方法:应用MTT比色法测定氯化两面针碱对细胞增殖的抑制作用;流式细胞术(FCM)检测氯化两面针碱对细胞周期的影响;RT-PCR技术和免疫细胞化学法检测cdc2和cyclinB1的mRNA水平及其蛋白表达.结果:氯化两面针碱在体外呈浓度依赖性显著抑制KB及KBV200细胞的生长,48 h IC50分别为(2.36±0.22) mg/L和(2.43±0.19) mg/L;与对照组相比,经3 mg/L氯化两面针碱作用, KB及KBV200 G0/G1期、S期细胞明显减少,G2/M期细胞显著增多(P＜0.01);cyclinB1的转录与表达降低(P＜0.01),而cdc2的转录与表达未见明显变化(P＞0.05).结论:氯化两面针碱有可能通过下调cyclinB1的转录与表达来诱导KB细胞及其耐药株KBV200的G2/M期阻滞,从而抑制其增殖.
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氯化两面针碱通过细胞色素c介导的线粒体凋亡途径诱导人结肠癌HT29细胞凋亡
目的:初步探讨氯化两面针碱(NC)对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响及其机制.方法:将HT29细胞分为溶剂对照组、15 μmol/L NC组、30μmol/L NC组和60 μmol/L NC组,采用CCK-8法检测NC对细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡,western blotting法检测细胞色素c(Cyt-c)和caspase-3蛋白的表达水平.结果:与对照组相比,各NC实验组的细胞存活率显著降低,凋亡率显著升高,15 μmol/L NC组、30 μmol/L NC组和60 μmol/L NC组细胞凋亡率分别为(35.30±14.30)％、(41.48±17.89)％和(46.51±11.35)％,差异具有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,不同浓度NC组Cyt-c和caspase-3蛋白表达明显上调(P＜0.05).结论:NC能够显著抑制人结肠癌HT29细胞的增殖,诱导HT29细胞凋亡,其分子机制可能与Cyt-c介导的线粒体凋亡途径有关.
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氯化两面针碱抑制肿瘤血管生成相关靶标蛋白的初步筛选
目的:初步筛选出氯化两面针碱(NC)抑制肿瘤血管生成的分子靶标.方法:将人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)分为空白对照组及不同浓度(30 μmol/L和60 μmol/L) NC的实验组,采用细胞划痕实验检测经NC干预24 h和48 h后HUVEC的迁移能力;western blotting法检测NC干预后HUVEC中血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达水平.以计算机辅助药物设计软件SYBYL 2.0对NC与肿瘤血管生成相关信号通路受体蛋白进行分子对接,以Pymol软件绘制三维结构图并分析NC与受体蛋白的相互作用.结果:与空白对照组比较,30 μmol/L和60 μmol/L NC实验组细胞迁移率显著降低(P＜0.001),各实验组的VEGF蛋白表达水平均显著下调(P＜0.01).分子对接结果表明,在肿瘤血管生成信号通路中NC与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和非受体酪氨酸激酶c-Src主要通过氢键和疏水场相互作用,亲和力较强.结论:NC能够下调VEGF的表达来抑制HUVEC的迁移,进而抑制肿瘤血管生成,PI3K和c-Src是NC抑制肿瘤血管生成的潜在靶标.
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氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇的体外肝细胞毒性研究
目的:观察氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇在体外对肝细胞的毒性作用.方法:大鼠肝脏经胰蛋白酶和胶原酶消化,进行体外肝细胞培养.经糖原染色法(PAS)鉴定后,采用MTT法检测不同浓度氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇对肝细胞的毒性作用.结果:氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇对肝细胞IC50分别为(3.501 5±0.672),(13.289 1±1.165)和(2.163 9±0.748)mg/L,且高抑制率均超过80%,从而说明氯化两面针碱、白花丹素和紫杉醇均对正常肝细胞有毒性作用.结论:氯化两面针碱、白花丹素、紫杉醇可抑制肝细胞的增殖,对肝细胞有一定的毒性.
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正交试验法优选外感风痧颗粒制剂的提取工艺
[目的]优选外感风痧颗粒制剂提取工艺.[方法]采用正交试验法,以得膏率、氯化两面针碱含量为评价指标,筛选出佳提取工艺.[结果]佳提取工艺为:选用粗粉药材,第1次加水12倍量,浸泡0.5h,提取时间为2h;第2次加水12倍量,提取时间为0.5h.[结论]优选工艺的提取条件稳定、合理、经济,适用于工业生产.
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氯化两面针碱对斑马鱼胚胎心脏影响的初步研究
目的 观察不同浓度的氯化两面针碱对斑马鱼心脏的影响.方法 用发育正常的受精后48 h(48 hpf)的斑马鱼胚胎作为实验模型,用浓度为5.00 mg/L、3.15 mg/L、2.00 mg/L、1.58 mg/L、1.12 mg/L的氯化两面针碱处理上述胚胎,分别于受精后60 h和72 h时观察胚胎心脏的形态及心率的变化.结果各给药组在受精后60 h和72 h时均出现胚胎心脏中毒现象.5.00 mg/L、3.15 mg/L实验组中,胚胎主要表现为心脏跳动停止、心脏区域出血,2.00 mg/L、1.58 mg/L、1.12 mg/L实验组的胚胎则主要表现为心脏发育畸形.心率随着浓度的升高而明显下降,随着暴露时间的延长,心率下降不明显.结论氯化两面针碱对斑马鱼胚胎有心脏毒性.
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基于FTIR技术和HPLC法的广西不同石山地区两面针化学成分比较分析
目的:研究两面针的红外光谱特征及不同石山地区两面针药材的差异,并结合高效液相色谱(HPLC)法分析广西不同石山地区两面针中生物碱的差异.方法:采集广西不同石山地区两面针药材,制备傅里叶变换红外光谱(FTIR)图,运用主成分分析法(PCA)研究不同谱图间的差异,结合HPLC法测定氯化两面针碱的含量.结果:两面针所处的地理位置、纬度、气候、年降雨量、土壤等外在条件不同,均能使其化学成分的含量存在差异.结论:运用FTIR技术可以快速鉴别出不同石山地区两面针主要化学成分的差异,并能够准确把握药材的整体信息.
关键词： 两面针 傅里叶变换红外光谱技术 高效液相色谱法 石山地区 氯化两面针碱 -
双波长HPLC法同时测定两面针药材中5种成分的含量
目的:建立同时测定两面针药材中5种成分含量的方法.方法:采用高效液相色谱法.色谱柱为LunaC18,流动相为乙腈-水(含0.2％磷酸、0.25％三乙胺)(梯度洗脱),流速为1.0 mL/min,检测波长为273、284 nm,柱温为30 ℃,进样量为20此.结果:别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素检测质量浓度线性范围分别为0.8～200、0.2～50、0.44～110、0.208～52、0.944～236 μg/mL(r均为0.999 9);精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0％;加样回收率分别为101.47％～103.92％(RSD=0.92％,n=9)、102.52％～104.68％ (RSD=0.63％,n=9)、97.55％～101.22％ (RSD=1.09％,n=9)、103.35％～104.93％(RSD=0.71％,n=9)、99.31％～103.86％ (RSD=1.34％,n=9).结论:该方法操作简便,精密度、稳定性、重复性好,可用于两面针药材中5种成分含量的同时测定.
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氯化两面针碱和芝麻素对斑马鱼胚胎的毒性效应研究
目的:研究氯化两面针碱和芝麻素单一和联合作用时对斑马鱼胚胎发育的表现影响.方法:采用半静态实验法,单一作用时,氯化两面针碱设置5个含药浓度组(4 μg/ml,5.25μg/nl,6.92 μg/ml,9.12μg/ml及12μg/ml);联合作用时,选取氯化两面针碱∶芝麻素=5∶4(联用Ⅰ),5∶1(联用Ⅱ),1∶5(联用Ⅲ)3个试验组,其中氯化两面针碱的浓度与单一用药时5个浓度一致.结果:单一用药时氯化两面针碱72hpf的半数致死浓度(LC50)为12.27μg/ml,96hpf时为7.57μg/ml,芝麻素在实验浓度范围内未显示出毒性作用;联合作用时,3个实验组的毒性作用均小于氯化两面针碱单一作用时.综合结果显示,3个联合用药组之间对斑马鱼胚胎的毒性作用不具有统计学差异.结论:氯化两面针碱和芝麻素联合作用时比氯化两面针碱单一作用时对斑马鱼胚胎发育的毒性明显为小.
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氯化两面针碱对人鼻咽癌细胞生长和转移的抑制作用
目的:探讨氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)对表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TPK)的抑制作用,并阐明其对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖和侵袭的抑制作用机制.方法:不同浓度氯化两面针碱加入到人鼻咽癌CNE-2细胞中,利用ELISA法研究了氯化两面针碱对EGFR-TPK活性的影响,利用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法测定氯化两面针碱对CNE-2细胞的抑制作用,Transwell法检测氯化两面针碱对CNE-2细胞侵袭的抑制作用,采用间接荧光标记法测定细胞内活性氧(ROS)水平的变化;酶标仪法检测氯化两面针碱对细胞凋亡蛋白Caspase-3活性的影响,凝胶迁移或电泳迁移率实验测定CNE-2细胞中NF-κB活性.结果:氯化两面针碱对EGFR-TPK IC50为(32.53±3.43 μmol/L)和CNE-2细胞生长IC50为(9.65±1.13) μmol/L都具有良好的抑制能力,氯化两面针碱能够诱导肿瘤细胞侵袭能力降低;在100μmol/L浓度的氯化两面针碱引起的ROS百分率达到了(76.39±5.32)％;与空白组相比,氯化两面针碱能显著提高CNE-2细胞中凋亡蛋白Caspase 3活性;氯化两面针碱能够下调NF-κB的表达.结论:氯化两面针碱通过多靶向降低EGFR-TPK活性、下调NF-κB的表达和激活Caspase3活性的方式,对人鼻咽癌细胞的侵袭和增殖产生抑制作用.
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氯化两面针碱固体脂质纳米粒大鼠体内药代动学研究
目的:比较氯化两面针碱固体脂质纳米粒和氯化两面针碱在大鼠体内的药动学.方法:12只Wistar大鼠随机分为2组,分别按剂量10mg/kg注射氯化两面针碱固体脂质纳米粒和氯化两面针碱,用高效液相法测定各时间点血药浓度,计算并分析药动学参数.结果:氯化两面针碱固体脂质纳米粒、氯化两面针碱T1/2分别为(276.9393±7.9606)、(163.519±9.9019) min; Cl(s)分别为(0.0599 ±0.0011)、(0.2037±0.0100)L·min/kg; AUC(0-t480)分别为(167.0805±3.2012)、(49.1851±2.3818) μg·min/ml.结论:氯化两面针碱固体脂质纳米粒与氯化两面针碱相比,具有长效和缓释的特点.
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氯化两面针碱的体内抗肿瘤作用及其机制
目的 研究氯化两面针碱的体内抗肿瘤作用及其对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)的影响,探讨其作用机制.方法 以S180荷瘤小鼠为研究对象,给予不同剂量的氯化两面针碱10 d,称取瘤重,计算抑瘤率,同时检测血清TNF-α、IL-2的含量.结果 2.5、5.0、10 mg·kg-1氯化两面针碱对S180肉瘤生长的抑制率分别为1.95%、27.3%、42.9%,氯化两面针碱组荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2的含量明显高于生理盐水组.结论 两面针碱具有抗肿瘤的作用,TNF-α、IL-2的释放可能是其抗肿瘤作用机制之一.
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氯化两面针碱体外诱导两种鼻咽癌株的细胞凋亡
目的 研究氯化两面针碱体外促进两种鼻咽癌细胞株凋亡的作用.方法 应用MTT法检测细胞的增殖活性,DNA ladder检测、细胞形态学观察、酶联免疫法进行检测分析.结果 氯化两面针碱对两种鼻咽癌7111, Ecv2细胞株的IC50分别为1.238±0.09、 1.641±0.331 μg · ml-1.在其作用下,两种鼻咽癌细胞株出现典型的凋亡特征,琼脂糖电泳出现典型的DNA梯带,细胞形态学表现出细胞核裂解、染色质聚集、核碎裂,胞浆浓缩、有空泡形成, ELISA法检测样本活性后发现药物作用后细胞中Caspase-3含量明显高于对照组(P＜0.05).结论 氯化两面针碱有促进两种鼻咽癌7111,Ecv2细胞株凋亡的作用.
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HPLC法测定三九胃泰颗粒中氯化两面针碱的含量
目的:建立高效液相色谱法测定三九胃泰颗粒中氯化两面针的含量的方法.方法:采用 Agilent 5 TC-C18(4.6mm×250.0mm)色谱柱为分析柱;采用流动相A:乙睛;B:0.2%的甲酸-三乙胺溶液(25∶75),进行洗脱;流速为1 mL/min;检测波长为271nm;柱温25 ℃;采用70%甲醇超声提取.结果:氯化两面针碱回归方程:Y=1316.9176X-0.5712,r=0.9999,在 0.0600~0.5997μg·mL-1范围内线性关系良好,平均回收率为99.88%,RSD=0.50%.结论:该方法简单准确、重复性好,可用于三九胃泰颗粒中氯化两面针碱的含量测定.
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氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的研究
目的 研究氯化两面针碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的作用.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测人肝癌细胞SMMC-7721生长活力;Hoechst33258核染色,观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率.结果 氯化两面针碱作用于细胞后,在体外呈浓度、时间依赖性显著抑制SMMC-7721细胞的生长,作用24、48、72h的半数抑制浓度(IC50)分别为(19.5±1.8)、(3.8±0.2)、(2.8±0.1)mg/L;Hoechst33258染色后,可见核染色质凝集,凋亡细胞呈致密浓染,与对照组相比,氯化两面针碱处理后凋亡细胞比例增加;流式细胞仪检测到G2/M细胞比例增加,G0/G1、S期细胞比例下降.药物作用于SMMC-7721细胞后,随浓度增加细胞凋亡率增加.结论 氯化两面针碱对SMMC-7721细胞有明显的生长抑制作用,可能与改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关.
关键词： 氯化两面针碱 SMMC-7721细胞 G2/M期阻滞 细胞凋亡 肝癌
