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串联鹿茸多肽基因在单一蛋白生产系统中的表达
目的 利用单一蛋白生产(SPP)系统可溶性表达串联鹿茸多肽(AP).方法 设计并合成由凝血酶Ⅹa序列间隔的5倍串联AP基因(5×AP),并将其克隆至冷休克表达载体中构建pColdⅡ(sp-4)-5×AP质粒,然后与pMazF质粒共转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中建立SPP系统,表达后经凝血酶Ⅹa水解获得AP.结果 5倍串联AP基因的碱基数为570 bp,在30℃下利用1 mol/L IPTG诱导表达的串联AP的分子量为18500,水解后获得的AP的分子量为3700.结论 利用SPP系统可成功表达纯度较高的串联AP,并可被凝血酶Ⅹa水解获得AP,为进一步研究基因工程方法制备AP的生物学性质奠定基础.
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鹿茸多肽药理作用的研究进展
鹿茸是鹿科动物梅花鹿或马鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角,具有免疫增强、神经保护、生殖促进、抗骨质疏松、抗衰老、抗肝纤维化和抗关节炎等多种功效.本文对鹿茸多肽的药理作用及未来展望进行综述.
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鹿茸多肽药理学活性的研究进展
鹿茸多肽是鹿茸的主要活性成分,具有保护神经、促进生殖功能、保护软骨组织、增强免疫力、保护心肌细胞和血管内皮细胞、预防急性肝损伤、抗炎及抑制肿瘤细胞生长的作用.本文将从以上几方面的作用展开叙述,希望对鹿茸多肽药理作用的进一步研究提供参考.
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两种鹿茸多肽生物学活性检测方法的比较
目的采用两种方法检测鹿茸多肽生物活性,并进行两种方法优劣比较.方法分别采用MTT比色法及3H-TdR掺入法检测多肽对NIH 3T3细胞增殖的影响.结果这两种方法均能检出多肽促进NH3T3细胞增殖的作用,且具有相关性,与对照组相比,差异有显著意义.结论 MTT比色法简便、迅速,重复性较差.3H-TdR掺入法灵敏度高,但有放射性污染.
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梅花鹿鹿茸活性多肽的提取及免疫功效的初步研究
目的 提取并分离纯化不同加工方法处理的梅花鹿鹿茸活性多肽(PAP),并对其免疫功效进行初步研究.方法 以不同工艺处理的鹿茸为原料,应用分子排阻层析和离子交换层析提取鹿茸活性多肽,通过淋巴细胞增殖、细胞因子产生等试验,检测PAP对淋巴细胞的免疫功效.结果 所提取的梅花鹿鹿茸活性多肽蛋白含量分别为:冻干茸9.20 mg/ml;冷冻鲜茸1.30 mg/ml;热炸茸1.10 mg/ml.鹿茸多肽可以促进小鼠T、B淋巴细胞的增殖,活化巨噬细胞分泌IL-12,对机体有免疫增强作用.结论 梅花鹿鹿茸活性多肽对机体的细胞免疫有显著增强作用.
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鹿茸多肽对微波辐射致小鼠卵巢次级卵泡发育损伤的保护作用
目的 研究鹿茸多肽(VAP)对微波辐射所致小鼠卵巢次级卵泡发育损伤的保护作用及其机制.方法 将75只8周龄昆明种雌性小鼠,随机分为对照组、微波辐射组(MR组)、MR+低VAP组、MR+中VAP组、MR+高VAP组,每组15只.除对照组外,其余小鼠进行5 mW/cm2强度的微波辐射30天;然后MR+低VAP组、MR+中VAP组、MR+高VAP组腹腔注射VAP 30天,剂量分别为1.5 mg·kg-1·d-1、3mg·kg-1 ·d-1和6mg·kg-1·d-1.观察小鼠卵巢组织中次级卵泡的发育情况,TUNEL法检测小鼠次级卵泡中颗粒细胞的凋亡,免疫组织化学法检测小鼠次级卵泡颗粒细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2和活化型促凋亡蛋白caspase-3的表达,ELISA法检测小鼠血清中雌激素水平.结果 与MR组比较,高浓度VAP显著提高了小鼠卵巢组织中次级卵泡的发育,改善其组织结构状态,显著减少次级卵泡颗粒细胞的凋亡和活化型促凋亡蛋白caspase-3的表达,升高次级卵泡颗粒细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达和小鼠血清中的雌激素水平.结论 VAP可显著修复微波辐射引起的小鼠卵巢次级卵泡发育损伤,其修复机制可能与减少次级卵泡中颗粒细胞凋亡,促进卵泡雌激素合成和分泌有关.
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鹿茸多肽提取工艺及其药理学作用
综述鹿茸多肽提取工艺及其药理学作用.鹿茸多肽的提取工艺包括萃取法、酶解法、超声波法、高压电场法.鹿茸多肽的分离纯化方法包括盐析法、超滤法、离子交换法、电泳法.鹿茸多肽的药理学作用广泛,主要对免疫系统、循环系统、神经系统、骨代谢以及糖代谢等起着重要作用,同时鹿茸多肽还具有抗炎、抗病毒、抗氧化和抗疲劳等作用.
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新疆塔里木马鹿鹿茸干鲜品活性多肽的对比研究
目的 通过对新疆塔里木马鹿鹿茸干鲜品为原料制备的多肽的提取方式、含量和在体外对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)增殖作用的比较,探讨新疆塔里木马鹿鹿茸的深加工和相关产品的开发原料选择的技术依据.方法 通过酸性缓冲液抽提和超滤等方法 制备得到马鹿鹿茸干鲜品多肽,以Folin-酚比色法测定其浓度,Tricine-SDS-PAGE电泳检测其相对分子质量(Mr)分布,MTT法检测其体外对MC3T3-E1细胞的增殖作用.结果 马鹿鹿茸鲜品多肽主要由Mr为14 400,9 500,6 500和4 100的多肽组成;而马鹿鹿茸干品多肽在Mr14 400和4 100～6 500之间的多肽含量较低.体外活性分析结果 显示,鲜品多肽能显著促进MC3T3-E1细胞增殖;而干品多肽促进MC3T3-E1细胞增殖效果不显著.结论 马鹿鹿茸鲜品多肽具有更高的促进成骨细胞增殖的作用.
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新疆不同产区塔里木马鹿鹿茸对比研究
目的 检测新疆5个不同产地塔里木亚种马鹿鹿茸质量性状、多肽(42,26,15 kDa)含量及其对小鼠前成骨细胞增殖和活性的影响.方法 对比分析不同产地鹿茸性状(直径、干鲜比、茸长、眉枝、水分、总灰分和浸出物);采用BCA蛋白定量试剂盒测定鹿茸多肽中的蛋白含量并作聚类分析,采用SDS-PAGE电泳法鉴别鹿茸多肽类型;建立小鼠成骨细胞模型,采用MTT及ELISA法分析其对细胞增殖和功能的作用.结果 不同产地塔里木鹿茸药材中鹿茸质量性状存在差异,塔里木河沙雅县鹿茸质量性状较好,鹿茸多肽含量高,显著提高了小鼠成骨细胞增殖率40.74％及碱性磷酸酶活性.结论 新疆沙雅地区塔里木亚种马鹿鹿茸活性较好.本实验为建立塔里木马鹿亚种鹿茸质量标准的提升提供了数据支撑.
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鹿茸多肽对β-淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用
[目的]探讨鹿茸多肽对β-淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用.[方法]体外进行胎鼠脊髓神经元细胞培养传代,细胞进入对数生长期后进行实验.MTT比色法检测不同浓度β-淀粉样蛋白作用24 h后细胞活力变化;检测25μmol/L β-淀粉样蛋白作用24 h后,细胞凋亡百分数和观察细胞caspase-3表达情况.[结果]不同浓度的β-淀粉样蛋白作用24 h后对细胞活力均明显下降,并呈剂量依赖性(P<0.05);鹿茸多肽可明显抑制β-淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡现象(P<0.05),且可使caspase-3的表达量下降.[结论]鹿茸多肽通过抑制β-淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞caspase-3表达增高而对其细胞凋亡发挥保护作用,本实验为探索新的治疗脊髓神经损伤的药物提供了重要的理论基础.
关键词： 鹿茸多肽 脊髓神经细胞 细胞凋亡 β-淀粉样蛋白 Casepase-3 -
鹿茸多肽对兔软骨细胞体外凋亡的影响
通过观察鹿茸多肽对白细胞介素-1β体外诱导软骨细胞凋亡的影响,以优化软骨组织工程的种子细胞.取新西兰大白兔关节软骨,用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化后获得兔软骨细胞,并于体外培养.将第3代软骨细胞随机分成A组(空白对照组),B组(IL-1β组),C组(鹿茸多肽组),D组(TGF-β1组).采用透射电镜观察细胞形态,用Annexin V法检测细胞凋亡率,RT-PCR技术分析Caspase-3 mRNA表达水平,ELISA法检测Caspase-3蛋白酶活性.结果显示B组24 h后细胞核内染色质开始呈块状凝集,分布于核膜下,核膜不规则;48 h后细胞核内染色质凝集加剧;72h后部分细胞内的核碎片凝集成凋亡小体;各时间点C、D组细胞结构改变相对滞后、且数量较少,而A组细胞结构几乎无明显改变.各时间点B组细胞凋亡率、Caspase-3 mRNA表达及蛋白酶活性逐渐增高,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.01);C、D组与B组比较则逐渐下降,且差异有统计学意义(P＜0.01).说明Caspase-3参与细胞凋亡,鹿茸多肽通过减少Caspase-3mRNA表达,并抑制其蛋白酶活性,来阻止或逆转软骨细胞凋亡.
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鹿茸多肽对人骨髓间质干细胞体外增殖的影响
为探讨鹿茸多肽(PAP)对人骨髓间质干细胞(MSCs)体外增殖的影响,采用密度梯度离心法分离扩增骨髓间质干细胞,并用流式细胞术检测其表面标志;用MTT比色、免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)、流式细胞术检测细胞周期等方法来反映MSCs的增殖.结果CD34、CD45表达阴性,CD29、CD90表达阳性;10μg/ml时PAP获得佳促进MSCs增殖效应,且PAP能消除MSCs在体外连续培养过程中异倍体的产生.说明PAP对人MSCs的增殖有明显促进作用,且能防止MSCs在体外连续培养过程中异行性的产生,为种子细胞的优化提供了理论和实验依据.
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鹿茸多肽对兔骨髓间充质干细胞移植修复关节软骨缺损的影响
为探讨经鹿茸多肽诱导的兔自体骨髓间充质干细胞-胶原膜支架(MCMG)复合物修复兔膝关节软骨缺损的效果,抽取兔骨髓液经体外分离、培养获得兔MSCs.选用健康的新西兰大白兔27只,随机分成A、B、C 3组.A组以未经诱导的自体MSCs-MCMG复合物修复兔膝关节软骨缺损;B组以经TGF-β1诱导后的自体MSCs-MCMG复合物修复兔膝关节软骨缺损;C组以经鹿茸多肽诱导后的自体MSCs-MCMG复合物修复兔膝关节软骨缺损.分别于术后2、4、8周取材,行HE、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色观察各组兔膝关节软骨缺损修复情况.结果显示术后8周,C组修复软骨缺损的效果无论从大体标本观察或是组织学检查都与B组的修复效果相当,而且C组与B组修复效果明显优于A组.说明经鹿茸多肽诱导的兔自体MSCs-MCMG复合物移植可提高兔膝关节软骨缺损的修复质量.
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鹿茸多肽对体外正常及凋亡软骨细胞代谢的影响
目的:观察体外培养软骨细胞在正常及凋亡状态下,其合成代谢功能的变化及鹿茸多肽对其影响.方法:将硝普钠(SNP)、鹿茸+SNP分别加入软骨细胞培养体系,采用同位素标记3H-TdR、3h-Pro掺入法测定软骨细胞DNA含量以及合成胶原、蛋白多糖的功能.结果:硝普钠诱导软骨细胞发生凋亡时,其合成DNA、分泌蛋白多糖及胶原功能也发生相应下降,鹿茸多肽对凋亡状态下软骨细胞合成代谢功能有一定的促进作用.结论:软骨细胞发生凋亡时,其合成代谢功能下降.鹿茸多肽对凋亡状态下软骨细胞合成代谢功能有一定的促进作用.
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鹿茸多肽-壳聚糖-蜂蜜混悬剂对猪皮肤褥疮的促愈合作用
[目的]探讨中成药制剂鹿茸多肽-壳聚糖-蜂蜜混悬剂对褥疮愈合的影响.[方法]采用猪压疮为褥疮模型.以蜂蜜为溶剂性载体,将鹿茸多肽和壳聚糖以不同比例混悬于蜂蜜中,制成混悬剂,敷于创面,每天1次,连续7 d,以后隔日换药一次.观察创面愈合情况,计算创面面积.观察创面病理组织学改变.[结果]鹿茸多肽-壳聚糖-蜂蜜混悬剂中鹿茸多肽与壳聚糖4:1组创面渗出少,肉芽组织生长快,结痂脱落早而完全.病理结果显示鹿茸多肽与壳聚糖4:1组无坏死组织,上皮化明显,炎症细胞少,无水肿,新生血管数多.[结论]鹿茸多肽-壳聚糖-蜂蜜混悬剂在褥疮的修复过程中起到明显的促进作用,其可能的机制有待于进一步研究.
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均匀设计优化鹿茸抗氧化多肽酶解工艺的研究
目的 研究鹿茸抗氧化多肽酶解优工艺条件.方法 以酶解水解度和DPPH自由基清除率为指标,在单因素实验基础上,采用均匀设计法优化鹿茸抗氧化多肽酶解工艺.结果 优工艺为:酶解时间58min,酶添加量5.0U/mg,底物浓度11 mg/ml,酶解温度60℃,pH值6.验证实验显示该条件下鹿茸多肽1)PPH自由基清除率为(71.5±0.9)％,比预测值稍低,基本相符.结论 均匀设计法优化的鹿茸抗氧化多肽酶解工艺稳定、可行,获得了抗氧化性较好的鹿茸多肽,对开发高附加值的鹿茸产品具有重要的意义.
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鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞的影响
目的:观察鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞的影响.方法:参考Hulth法建立骨性关节炎模型,给予不同浓度的鹿茸多肤进行干预,分别进行MTT法检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,获得鹿茸多肽对软骨细胞作用.结果:鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞有一定的增殖作用,骨性关节炎软骨细胞直接分泌到胞外的基质金属蛋白酶含量变化不明显,骨性关节炎软骨细胞核酸中金属蛋白酶有一定表达.结论:骨性关节炎软骨细胞在正常分化及增殖发生改变过程中,其软骨基质的降解是金属蛋白酶与其它因子协同作用的结果;鹿茸多肽有促进骨性关节炎软骨细胞增殖作用,并可抑制骨性关节炎软骨细胞中金属蛋白酶的过度表达,可能对治疗骨性关节炎有较好的作用.
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鹿茸多肽对兔骨髓间质干细胞体外增殖的影响
目的探讨鹿茸多肽(PAP)对兔骨髓间质干细胞(MSCs)体外增殖的影响.方法分离MSCs,并用流式细胞术检测CD34、CD45、CD29、CD90表达;将MSCs分为对照组、PAP不同浓度组、转化生长因子-β1(TGF-β1)组,培养48 h后用四唑盐比色法测细胞活力、流式细胞术测细胞增殖指数(PI)、免疫组织化学Envision二步法测增殖细胞核抗原(PCNA)表达.结果CD34、CD45、CD29、CD90分别为0.81%、0.09%、95.90%、67.00%;PAP不同浓度组与TGF-β1组吸光度值与PI较大,免疫组织化学表达棕褐色颗粒较多,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.0.1);PAP不同浓度组MSCs在体外连续培养中没有异倍体的产生.结论PAP对兔MSCs的增殖有促进作用,且能逆转MSCs体外连续培养中异行性的产生.
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鹿茸多肽对东莨菪碱所致大鼠学习记忆障碍作用及脑内ACh和AChE影响
目的:观察鹿茸多肽对东莨菪碱所致大鼠学习记忆障碍的作用及脑内ACh和AChE的影响.方法:60只经过跳台实验筛选过的200～220gWistar大鼠(雌雄各半)随机分为六组:空白组、模型组、吡拉西坦阳性组(300mg/kg)、鹿茸多肽高剂量组(40mg/kg)、鹿茸多肽中剂量组(20mg/kg)、鹿茸多肽低剂量组(10mg/kg),空白组与模型组给予同体积纯净水17天,鹿茸多肽给药第8天,除空白组外,其他组按0.3mg/kg给予醋酸地塞米松造阳虚模型.第18天进行跳台训练,第19天,给药1h后,按2mg/kg腹腔注射东莨菪碱造模,15min后进行跳台实验,测试结束后,断头取脑组织测试ACh和AChE.结果:鹿茸多肽各剂量组可以明显改善东莨菪碱所致大鼠学习记忆障碍,且可以提高ACh含量,降低AChE活性.结论:鹿茸多肽对东莨菪碱所致记忆障碍模型小鼠学习记忆障碍有一定的改善作用.
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鹿茸多肽对东莨菪碱致学习记忆障碍大鼠脑内SOD、MDA和GSH-Px表达影响研究
目的:观察鹿茸多肽对东莨菪碱致学习记忆障碍大鼠的脑内SOD、MDA和GSH-Px表达水平的影响.方法:将60只Wistar大鼠(200～220g,雌雄各半)随机分为空白对照组、模型对照组、阳性治疗组及鹿茸多肽高、中、低剂量组各10只,阳性治疗组大鼠给予吡拉西坦300mg/kg灌胃,鹿茸多肽组大鼠分别给予吡拉西坦40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg灌胃,空白对照组、模型对照组大鼠给予等体积纯净水灌胃,共17天.第8天,除空白对照组外,其他各组大鼠给予醋酸地塞米松0.3mg/kg灌胃制备阳虚模型.第18天,跳台训练.第19天,给药1h后,腹腔注射东莨菪碱2mg/kg造模,15min后进行跳台实验.实验结束后,取脑组织并测试SOD、MDA和GSH-Px的活性.结果:鹿茸多肽各剂量组均可提高SOD的含量,降低MDA、GSH-Px活性.结论:鹿茸多肽对东莨菪碱致记忆障碍模型大鼠学习记忆障碍有一定的改善作用.
