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Cx32调控肝癌细胞上皮间质转化的机制
目的 探讨缝隙连接蛋白32(Cx32)在肝癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用及其机制.方法 在HepG2细胞(对阿霉素敏感)中干扰Cx32的表达,在HepG2/doxorubicin(DOX)细胞(对阿霉素耐药)中过表达Cx32,Western blot测定Cx32、p-Akt的表达水平.20μmol/L的LY294002(PI3K/Akt信号通路的抑制剂)作用于HepG2/DOX细胞24 h,Western blot检测p-Akt、E-cadherin、vimentin的表达水平,Transwell实验检测细胞的侵袭、迁移能力.在干扰Cx32的HepG2细胞中,用20μmol/L的LY294002作用于细胞24 h,Western blot检测E-cadherin、vimentin的表达水平,Tran-swell实验检测细胞的侵袭、迁移能力.结果 Western blot结果显示,在HepG2细胞中干扰Cx32的表达后,p-Akt的表达升高(P<0.05);在HepG2/DOX细胞中过表达Cx32后,p-Akt的表达降低(P<0.05).20μmol/L的LY294002作用于HepG2/DOX细胞24 h后,p-Akt、vimentin的表达降低,E-cadherin的表达升高(P<0.05),且细胞的侵袭、迁移能力降低(P<0.05).在HepG2细胞中干扰Cx32的表达后,细胞中E-cadherin的表达降低,vimentin的表达升高(P<0.05),且细胞的侵袭、迁移能力显著增加(P<0.05);而在干扰Cx32的HepG2细胞中,用20μmol/L的LY294002作用于细胞24 h后,细胞中E-cadherin、vimentin的表达均没有显著变化(P>0.05),细胞的侵袭、迁移能力也无显著改变(P>0.05).结论 Cx32可调控肝癌细胞中PI3K/Akt信号通路的活性,LY294002可逆转HepG2/DOX细胞的EMT,Cx32可能是通过PI3K/Akt信号通路调控肝癌细胞EMT.
关键词： 缝隙连接蛋白32 肝癌细胞株 PI3K/Akt信号通路 阿霉素 -
急性肝功能衰竭模型大鼠缝隙连接蛋白的表达
背景:缝隙连接蛋白是组成相邻细胞间通道的主要结构,承担着细胞间的多种物质传输和信息交流的作用,可协助调节细胞的生长和分化.目的:观察急性肝功能衰竭大鼠缝隙连接蛋白32表达与肝细胞增生的关系.方法:采用乳果糖+庆大霉素灌胃和四氯化碳+橄榄油腹腔注射法建立大鼠急性肝功能衰竭模型.造模前7 d,苯巴比妥组大鼠用含体积分数0.08%苯巴比妥的水喂养,直至取材.对照组大鼠不造模,仅腹腔注射橄榄油与生理盐水的混合物.分别于造模后1,3,7,10,14 d取材.结果与结论:大鼠肝功能衰竭后,部分大鼠出现死亡,存活大鼠肝细胞出现变性坏死,谷丙转氨酶明显升高,肝细胞间缝隙连接蛋白32 mRNA及蛋白表达明显降低.苯巴比妥可降低肝功能衰竭大鼠的死亡率,同时在一定程度上降低肝功能衰竭大鼠谷丙转氨酶水平及肝细胞间缝隙连接蛋白32 mRNA及蛋白的表达.说明通过苯巴比妥预先下调肝细胞间的缝隙连接蛋白32水平可以减轻急性肝功能衰竭大鼠急性期的肝脏损害,促进残存肝细胞增生和肝功能的好转,降低急性肝功能衰竭大鼠的病死率.
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缝隙连接蛋白32(CX32)在癫痫发病中的作用
目的初步探讨由CX32组成的缝隙连接与癫痫之间的关系.方法利用免疫组织化学方法、West-ernblot方法测定KA致痫后大鼠不同脑区、不同时程的CX32的分布及表达.结果KA致痫后大鼠的大脑皮层及海马均有CX32阳性表达.KA注射致痫后的早期CX32的表达明显增强,第3天达到高峰,中、后期其表达逐渐减弱,表达量也逐渐减少.上述变化在海马比皮层明显.结论神经元上的由CX32组成的GJ可能在癫痫的始动和发生上有一定的作用,但在长期的、慢性的癫痫过程中其对癫痫的发生和发展的作用是逐渐减弱的.
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慢性脑低灌注大鼠海马缝隙连接蛋白32和36的表达变化
目的:观察慢性脑低灌注大鼠海马组织中缝隙连接蛋白(Cx)32和Cx36的变化,探讨其在慢性脑低灌注认知功能损害中的作用.方法:双侧颈总动脉永久性结扎(2VO)制作慢性脑低灌注模型,Morris水迷宫检测2VO大鼠空间学习记忆能力变化,免疫组化检测2VO大鼠海马各区Cx32和Cx36的表达水平.结果:慢性脑低灌注大鼠的空间学习记忆能力较假手术对照组显著下降,海马Cx32和Cx36的表达也有降低.结论:Cx32和Cx36可能参与了慢性脑低灌注导致的认知功能损害.
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慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响
目的 构建LV5-hCx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响.方法 采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-hCx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度.将慢病毒载体LV5-hCx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养.qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化.结果 双酶切及测序结果表明LV5-GFP-hCx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×1011TU·L-1的重组慢病毒LV5-GFP-hCx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ.过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P＜0.05).结论 成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力.
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缝隙连接蛋白26缺陷聋的神经细胞中缝隙连接蛋白的表达差异
目的:通过诱导多能干细胞(iPSCs)技术获得缝隙连接蛋白26(Cx26)缺陷聋患儿的神经细胞,研究Cx26缺陷对神经细胞发育和基因表达的影响.方法:从3例Cx26缺陷造成的极重度耳聋患儿取得成纤维细胞,将之诱导为数个非整合iPSC细胞系,鉴定这些细胞系的形态和内源性、外源性基因表达.然后将这些细胞系向神经细胞方向分化,检测整个过程中形态、多能性基因、神经标记物、缝隙连接蛋白基因表达变化.结果:能够成功建立Cx26缺陷的3个iPSC细胞系,并且可以在体外分化为神经前体细胞和神经元细胞;这些细胞的形态、增殖、内源性、外源性基因表达与人胚胎干细胞基本一致;iPSC细胞系分化出的神经元细胞中,Cx32的表达明显上调,Cx36的表达略微上调,Cx26的表达没有明显变化.结论:Cx26缺陷不影响诱导多能干细胞的神经分化,但其过程中Cx32和Cx36表达上调,提示Cx32可能对Cx26缺陷发挥了代偿作用.
关键词： 缝隙连接蛋白26 缝隙连接蛋白32 非整合诱导多能干细胞 疾病模型 -
颞叶癫痫大鼠缝隙连接蛋白32表达变化的实验研究
目的 建立大鼠颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)模型,观察大鼠缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的表达变化,进一步探讨TLE发病机制.方法 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠88只,随机为正常对照组(n=8)、手术对照组(n=40)和红藻氨酸(KA)致痫组(n=40),其中手术对照组和KA致痫组又按术后3 h、6h、12、24h和7 d分为5个亚组.每组8只.通过免疫组织化学染色检测各组cx32蛋白的表达变化.结果 KA致痫后3 h大鼠的颠叶皮层区及海马区Cx32阳性表达逐渐增多,并持续上升,时程越长阳性表达越多,平均光密度值越高(P<0.01).KA致痫后各时间点cx32平均光密度值明显比对照组增多,差异有显著性(P<0.05);手术对照组与正常对照组相比,Cx32平均光密度值差异无显著性(P>0.05).KA致痫后大鼠颞叶皮层区及海马区均有Cx32阳性表达,海马区Cx32平均光密度值明显比颞叶皮层高(P<0.05 o结论cx32可能参与颞叶癫痫的发生发展过程,提示cx32特异性的抑制剂有可能为颞叶癫痫的临床治疗开辟新的前景.
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黄芩素增强Cx32组成的细胞缝隙连接提高顺铂的细胞毒性
[目的]黄芩素在转染并稳定表达Cx32的HeLa细胞上,对顺铂细胞毒性的影响及其与GJ的关系.[方法]SRB检测黄芩素对HeLa32细胞增殖性的影响,Parachute assay检测黄芩素对Cx32组成的GJ功能的影响.细胞集落实验用于检测黄芩素对顺铂细胞毒性的影响及其与Cx32组成的GJ的关系.Western blotting检测对Cx32蛋白的影响.[结果]黄芩素24 h,100 μmol/L浓度以下不影响Hela32细胞增殖.黄芩素(0.0125 ～0.1 μmol/L)能浓度依赖性地增强Hela32细胞间的荧光传递.黄芩素(0.1 μmol/L)分别作用4h,12h,和24 h,细胞间荧光传递强的作用时间是4h.在生长融合细胞组(有GJ形成),黄芩素可以提高顺铂对HeLa32细胞的细胞毒性.在生长未融合细胞(无GJ形成),或用GJ抑制剂oleamide阻断GJ功能,黄芩素不改变顺铂对细胞的杀伤作用.多西环素调控HeLa32细胞Cx32的表达与GJ的形成.在生长融合细胞,不表达Cx32(无GJ形成),可以降低黄芩素增强顺铂细胞毒性的作用.在生长未融合细胞(无论Cx表达与否,均无GJ形成),改变Cx表达无此效应.黄芩素0.0125 ～ 0.1 μmol/L作用细胞4h,对Cx32蛋白表达没有影响.黄芩素0.1μmol/L,作用细胞4h,12h,和24 h,对Cx32蛋白表达没有影响.[结论]黄芩素可增强HeLa32细胞GJ功能,提高顺铂的细胞毒性.黄芩素影响Cx32组成的GJ功能不伴有Cx32蛋白表达的增加.
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紫草素对Cx32蛋白组成的细胞缝隙连接功能的影响
目的 探究紫草素对宫颈癌Hela细胞缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)和缝隙连接蛋白32(Cx32蛋白)表达水平的影响. 方法 将细胞分成两组培养,加多西环素为诱导组,不加多西环素为非诱导组,采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测不同浓度紫草素对Hela细胞毒性的影响;采用细胞接种荧光示踪法(parachute assay)观察不同浓度紫草素对缝隙连接(gap junction,GJ)功能的影响;采用蛋白免疫印迹法(western-blot)研究紫草素在影响GJ功能浓度范围内对Cx32蛋白表达的影响. 结果 紫草素在0~4 μmol/L浓度时对非诱导组Hela细胞无毒性作用;紫草素在0~3 μmol/L浓度时对诱导组Hela细胞无毒性作用;诱导组细胞在紫草素1~3 μmol/L浓度时荧光传递量会随浓度增加;紫草素(1~3 μmol/L)能浓度依赖性增强GJ功能及Cx32蛋白表达量. 结论 紫草素能够增强Cx32组成的细胞GJ功能,这种增强作用可能与其增加Cx32蛋白表达水平有关.
关键词： 紫草素 缝隙连接蛋白32 细胞缝隙连接通讯功能
