首页 > 文献资料
-
烟碱对新生牛脑微血管内皮损伤的作用机制
烟碱是使人们吸烟成瘾的主要物质,已有研究表明,烟碱对心脑血管等组织和器官有直接损伤作用.本研究采用新生牛脑组织,分离培养脑微血管内皮细胞,观察烟碱作用于内皮细胞后细胞黏附分子的表达,探讨了烟碱对脑血管损伤的分子机制,主要结果如下:
-
不同状态的大鼠星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞血脑屏障特征性酶的影响
目的:探讨不同状态下大鼠星形胶质细胞(AS)条件培养液对脑微血管内皮细胞(BMEC)活性和血脑屏障特征性酶的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用.方法:收集正常、激活、激活合并通络救脑注射液处理、损伤、损伤合并通络救脑注射液处理5种不同状态的星形胶质细胞条件培养液,分别作用于拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞,采用MTT法检测细胞活性,微量酶标仪法和上机比色法检测碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)的活性.结果:正常星形胶质细胞条件培养液能明显提高受损内皮细胞活性,诱导AKP、γ-GT活性增强,激活的星形胶质细胞条件培养液上述作用下降,而损伤后的星胶条件培养液对受损内皮细胞几乎无作用.通络救脑注射液作用于激活和损伤星形胶质细胞后,其条件培养液提高内皮细胞活性和AKP、γ-GT活性的作用显著增强.结论:正常AS的分泌产物对提高BMEC的活性和维持血脑屏障特性具有重要意义,AS受损后,该作用减弱或消失,通络救脑注射液可显著提高AS对受损BMEC活性和功能的保护作用,这可能是该药物发挥脑缺血性损伤后血脑屏障稳定作用的内在机制之一.
关键词： 星形胶质细胞条件培养液 脑微血管内皮细胞 AKP γ-GT 通络救脑注射液 -
脑微血管内皮细胞条件培养液对体外培养正常神经元的影响
目的:探讨体外模拟脑缺血再灌注损伤条件下及通络救脑注射液干预下脑微血管内皮细胞条件培养液(CMEX-CM)对体外正常培养神经元的影响.方法:先分别进行大鼠大脑微血管内皮细胞和神经元的分离纯化培养及建立体外模拟脑缺血再灌注损伤模型,然后用收集的CMECs～CM 1:1和1:5的浓度作用于体外培养的神经元,MTT法测定神经元的活性、存活率,western～blot检测NF-KB的表达.结果:脑微血管内皮细胞条件培养液可影响神经元生存活性,应用中药通络救脑注射液作用于脑微血管内皮细胞后收集的条件培养液可明显提高神经元的生存活性,可以提高神经元中NF-KB的表达.
-
缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞Necroptosis模型的建立
目的:采用拟缺血再灌注损伤结合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone,z-VAD-FMK)干预,探索一种脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)Necroptosis模型.方法:首先利用原代大鼠脑微血管内皮细胞,采用氧糖剥夺及复氧复糖方法,筛选出拟缺血再灌注损伤时间点.在拟缺血再灌注模型基础上,予Casepase抑制剂z-VAD-FMK 20 μmol/L干预,采用CCK-8检测细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构;Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞死亡方式.结果:确定氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h,作为拟缺血再灌注时间点;z-VAD-FMK作用于拟缺血再灌注损伤BMECs后,细胞活性无统计学意义;z-VAD-FMK干预组在电镜下呈现明显的Necroptosis特征;流式检测显示,各象限细胞比率无明显变化,但Necroptosis特异性抑制剂Nec-1可显著降低Q2象限细胞比率,提示z-VAD-FMK干预抑制了细胞晚期凋亡,诱导了Necroptosis的发生.结论:z-VAD-FMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis,为以后研究缺血性脑中风necroptosis机制提供了细胞实验模型.
-
三七总皂苷对拟缺血脑微血管内皮细胞RIG-Ⅰ表达的影响
目的:研究三七总皂苷对拟缺血损伤的脑微血管内皮细胞维甲酸诱导基因-Ⅰ(Retinoic Acid-inducible Gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的影响.方法:采用原代培养大鼠脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cell,BMEC),氧糖剥夺法制备拟缺血损伤模型,首先用不同浓度梯度的三七总皂苷进行干预,筛选出三七总皂苷的佳用药浓度,然后分别采用荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中RIG-Ⅰ mRNA及蛋白的表达水平.结果:三七总皂苷在22 μg/mL浓度时能够显著提高拟缺血损伤脑微血管内皮细胞的活性,同时能够从基因和蛋白水平下调RIG-Ⅰ的表达.结论:三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞具有保护作用,提示三七总皂苷在缺血性脑损伤中使RIG-Ⅰ的表达下调可能是其发挥抗炎作用的内在分子机制之一.
-
银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖再灌注诱导脑微血管内皮细胞和SH-SY5Y细胞炎性损伤的保护作用与机制
目的:探讨银杏蜜环口服溶液对缺氧缺糖再灌注诱导脑微血管内皮细胞和神经胶质瘤细胞SH-HY5Y损伤的保护机制,以及其对eNOs介导的Beclin-1依赖的自噬通路的影响.方法:本研究采用缺氧缺糖再灌注诱导大鼠脑微血管内皮细胞和神经胶质瘤细胞SH-HY5Y构建糖氧剥离+复糖复氧模型,同时给予不同浓度的银杏蜜环口服溶液(5.15 mg/mL、2.575 mg/mL和1.545 mg/mL)及有效组分进行干预,通过观察细胞培养上清炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度和自噬通路的活化,并采用PI/Annexin V双染色分析细胞凋亡率,探讨银杏蜜环有效成份的脑保护机制.结果:银杏蜜环口服溶液5.15 mg/mL、2.575 mg/mL和1.545 mg/mL3个剂量组均可抑制脑微血管内皮细胞上清液TNF-α、IL-1β和IL-6含量,银杏蜜环口服溶液2.575 mg/mL和1.545 mg/mL可抑制Caspase3、LC3II和Beclin-1表达.同时,银杏蜜环口服溶液2.575 mg/mL明显促进eNOs的磷酸化.其中对L-1β和IL-6的作用明显优于银杏叶提取物和天麻蜜环菌.银杏蜜环口服溶液2.575 mg/mL和1.545 mg/mL还可降低SH-SY5Y细胞的凋亡率(Annexin V+/PI-细胞),差异有统计学意义.结论:银杏蜜环口服溶液可通过促进一氧化氮合酶eNOs的磷酸化来抑制缺糖缺氧再灌引发的细胞凋亡和自噬.
-
桂皮醛解热作用及机制的实验研究
目的:探讨桂皮醛解热作用及其作用机制.方法:采用酵母诱致大鼠发热模型和白细胞介素-1β(IL-1β)刺激小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)作为实验体系,采用酶联免疫法(ELISA)测定致热大鼠下丘脑组织及bEnd.3细胞上清液中前列腺素E2(PGE2)含量.结果:桂皮醛能有效抑制酵母所致大鼠发热反应,显著降低发热大鼠下丘脑PGE2含量,亦能明显抑制IL-1β刺激bEnd.3细胞PGE2的释放.结论:桂皮醛具有明显的解热作用,其解热机制可能与影响PGE2含量有关.
-
桂枝汤四个主要组成成分不同组合对白细胞介素1β刺激的脑微血管内皮细胞分泌前列腺素E2的影响
目的:研究桂枝汤四个主要组成成分不同组合对白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)刺激的大鼠脑微血管内皮细胞分泌前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的影响.方法:通过放免法测定这些不同组合成分作用细胞后的上清液PGE2含量.结果:组合中有20组成分组合能降低因IL-1β刺激而产生的PGE2含量,并有统计学意义.结论:这些成分的组合有可能是桂枝汤有效部位A双向调节体温的物质基础.
-
桂枝汤及其生物转化模拟产物对IL-1β介导的bEnd.3细胞PGE2代谢通路的影响
目的:研究桂枝汤及其生物转化模拟产物对白细胞介素-1β(IL-1β)介导的小鼠脑微血管内皮细胞株(bEnd.3)细胞前列腺素E2(PGE2)代谢通路的影响.方法:制备了桂枝汤及桂枝汤生物转化模拟产物的含药血清(分别设五个浓度组),采用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印记法(Western blot),观察桂枝汤及其生物转化模拟产物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞磷酸化丝裂原活化的蛋白激酶p38(p-p38 MAPK),胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)、分泌型磷脂酶A2(sPLA2)、环氧合酶2(COX-2)、前列腺素E合成酶(PGEs),15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH),磷酸化核因子κB(p-NF-κB)以及前3列腺素E2(PGE2)分泌及表达的影响.结果:IL-1β作用于细胞10 h后,各项指标均明显上调,与对照组比较,P<0.01.除质量终浓度为2.5%的桂枝汤含药血清对PGEs,sPLA2;终浓度为1%的模拟药对PGEs;终浓度为2.5%的含药血清对PGEs,sPLA2,cPLA2作用不显著外,其他各浓度组与模型组比较均出现显著性差异.结论:桂枝汤及其生物转化模拟产物对IL-1β刺激bEnd.3细胞合成PGE2的代谢酶系统有不同程度的抑制作用,从而降低了前炎症介质和中枢发热介质PGE2的释放和分泌.结果提示,桂枝汤及其生物转化模拟产物对脑微血管内皮细胞分泌PGE2具有相似的药效,为模拟产物的应用和开发提供了实验支持.
-
大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液对皮层神经元活性的影响以及通络救脑注射液的干预作用
目的:探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对神经元活性的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用.方法:制备正常、正常用药、拟缺血损伤、拟缺血损伤用药4种脑微血管内皮细胞条件培养液(N-CM、NT-CM、I-CM、IT-CM),分别作用于培养的皮层正常神经元和拟缺血损伤神经元,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测分析各个条件培养液对神经元活性的影响特征.结果:①N-CM对正常神经元无明显影响,但对拟缺血损伤的神经元表现出一定的保护作用,尤其是NT-CM可明显提高受损的神经元活性;②I-CM可降低正常神经元活性,对已受损的神经元则进一步加重损伤,IT-CM可明显改善这种损伤状态.结论:脑微血管内皮细胞的旁分泌作用可能在中枢系统缺血性损伤中起重要作用,有可能是不能透过血脑屏障的中药成分发挥治疗作用的靶点.
-
新清开灵注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤微血管内皮细胞黏附分子表达的影响
目的:观察培养的大鼠脑缺血再灌注损伤微血管内皮细胞体外黏附分子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的变化,探讨新清开灵注射液阻抑脑缺血炎症反应的作用途径.方法:采用分离脑微血管段并消化的方法体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法(Kreb液,95%N2+5%CO2)模拟缺血再灌注损伤,分别采用免疫细胞化学染色和 RT-PCR 方法半定量检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1的蛋白 mRNA 表达和 mRNA 转录水平.结果:与正常组比较,模型组 ICAM-1、VCAM-1 的蛋白和mRNA 表达均明显增高(P＜0.05);与模型组比较,清开灵组显著降低其蛋白表达和 VCAM-1 mRNA 转录水平(P＜0.05);新清开灵注射液对 ICAM-1 和 VCAM-1 的蛋白和 mRNA 表达都有明显的抑制作用(P＜0.05).结论:新清开灵注射液通过干预黏附分子表达而阻抑脑缺血损伤炎症反应.
-
补阳还五汤含药血浆和血清对缺氧损伤大鼠BMECs纤溶系统和黏附分子表达影响及与体内实验的比较研究
目的:比较补阳还五汤含药血清和含药血浆对缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)纤溶系统和黏附分子的表达与体内实验真实值的接近程度,为半体内实验选择含药血浆还是含药血清提供参考依据.方法:用颈内动脉线栓法建立局灶性脑缺血模型,缺氧培养箱孵育BMECs,采用ELISA法测定PAI-1、tPA的表达,RT-PCR法检测ICAM-1、VCAM-1 mRNA的含量,Western Blot法测定ICAM-1、VCAM-1蛋白的含量.结果:补阳还五汤含药血浆较含药血清更显著降低缺氧损伤大鼠BMECs PAI-1、增强tPA水平,含药血浆和含药血清均能明显降低ICAM-1、VCAM-1、ICAM-1 mRNA及VCAM-1 mRNA含量,与空白血浆、空白血清比较,差异显著(P＜0.05);半体内实验的含药血浆与体内实验真实值各指标相关系数均高于含药血清.结论:含药血浆比含药血清更接近体内真实情况,在进行半体内实验研究中药复方对纤溶系统和黏附分子蛋白及mRNA表达的影响时,特别是研究纤溶系统PAI-1和tPA指标的表达时,建议优先选择血浆药理学方法.
-
三七、栀子组分配伍对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞氧化应激反应的影响
目的:研究通络救脑注射液中三七总皂苷、栀子苷组分配伍对拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞氧化应激反应的药效特征.方法:采用原代培养大鼠脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血损伤模型,三七总皂苷、栀子苷以及通络救脑注射液干预后,采用CCK8法测定各组微血管内皮细胞活性的变化,生化法检测丙二醛(Malonic dialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(Superoxidase dismutase,SOD)活性.结果:3种药物均可有效提高拟缺血损伤内皮细胞活性,其中栀子苷在降低脂质过氧化的产物MDA含量上优于三七总皂苷,而三七总皂苷在提高氧自由基清除酶SOD活性上优于栀子苷,通络救脑注射液均优于两有效组分.结论:栀子苷的抗氧化作用可能与抑制自由基的脂质过氧化反应途径有关,三七总皂苷可能与增强自由基的清除有关,通络救脑注射液整体上明显优于2个组分,显示了中药组方配伍发挥整合调节的治疗优势.
-
通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞BDNF表达的影响
目的:研究通络救脑注射液及其2组分三七总皂苷、栀子苷对拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的影响.方法:采用原代培养大鼠脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血损伤模型,三七总皂苷、栀子苷以及通络救脑注射液干预后,采用免疫蛋白印迹法和细胞免疫荧光法检测BDNF的表达情况.结果:与模型组比较,栀子苷对BDNF的上调作用不明显,三七总皂苷和通络救脑注射液可显著上调BDNF的表达,通络救脑注射液有优于2组分的作用趋势.结论:通络救脑注射液及其有效组分具有一定的促进BDNF表达的作用,这可能是该注射液在缺血性脑损伤后保护微血管和促进血管新生的内在机制之一.注射液的作用优于2组分,体现了中药复方的配伍优势.
-
通络救脑注射液及其组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3表达及其功能的影响
目的:观察通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞谷氨酸受体3(glutamate receptor 3,GluR3)表达及其功能的影响.方法:采用大鼠原代培养脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血模型,分别用通络救脑注射液及其2组分栀子苷、三七总皂苷对细胞进行干预,采用PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中GluR3 mRNA及蛋白表达水平,并用免疫蛋白印迹法检测GluR3调节的下游分子基质金属蛋白酶诱导因子CD147、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表达情况.结果:通络救脑注射液及其组分能够从基因到蛋白水平显著下调GluR3的表达,对CD147、MMP-9也有显著下调作用,且通络救脑注射液疗效优于2组分.结论:通络救脑注射液及其组分可调节拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3的表达及其功能,这可能是其在脑缺血性损伤中保护血脑屏障、减轻炎症反应的机制之一.通络救脑注射液效果优于2组分,显示了复方配伍发挥整合调节的疗效优势.
-
三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞PLA2G4A表达及其下游产物的影响
目的:观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞胞浆型磷脂酶A2IVA(phospholipase A2 group ⅣA,PLA2G4A)表达及其功能的影响.方法:培养大鼠原代脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法制备拟缺血模型,用三七总皂苷及PLA2G4A抑制剂进行干预,通过RT-PCR和Western blotting法检测各组PLA2G4A基因及蛋白表达水平,ELISA法检测各组花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)、血栓素A2(thromboxanea2,TXA2)/前列环素(prostaglandin I2,PGI2)表达水平.结果:三七总皂苷可显著下调PLA2G4A的基因和蛋白表达,对AA、20-HETE、TXA2/PGI2也有下调作用.结论:三七总皂苷可以下调拟缺血损伤脑微血管内皮细胞PLA2 G4A及其下游产物的表达,这可能是三七总皂苷在脑缺血损伤中发挥化瘀通络作用的机制之一.
-
疏血通注射液抗栓、溶栓作用机制的研究
目的:探讨疏血通注射液对在体和体外培养的脑组织微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC)分泌组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogeon activator,tPA)的影响.方法:①在体实验中大鼠随机分为3组:假手术组、局灶脑缺血组、疏血通注射液治疗组.治疗5 d后取脑组织标本,用RT-PCR测脑组织tPA mRNA的表达,发色底物法测脑组织tPA的活性;②体外实验:培养鼠脑微血管内皮细胞,分实验组和对照组,试验终点,收集细胞及细胞上清液,用RT-PCR方法检测培养细胞中tPA mRNA的表达,发色底物法测细胞上清液中tPA的活性.结果:疏血通治疗组脑组织和疏血通干预组细胞tPA mRNA的表达及tPA的活性均明显高于对照组.结论:疏血通注射液可促进脑组织及BMEC分泌tPA,增强纤溶活性.
关键词： 疏血通注射液 脑缺血 脑微血管内皮细胞 组织型纤溶酶原激活剂 -
邻甲氧基桂皮醛对IL-1刺激脑微血管内皮细胞COX活性及PGE2释放的影响
目的:观察桂枝汤有效部位A分离的邻甲氧基桂皮醛对发热相关的环氧酶(COX)和前列腺素E2(PGE2)的影响.方法:建立大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC)培养,进行Ⅷ因子相关抗原鉴定.待细胞生长至融合状态后加入不同含量的邻甲氧基桂皮醛(12.5,25,50,100,200μg·mL-1)孵育3 h,之后以30ng·mL-1的IL-1刺激12 h.ELISA方法检测细胞培养液中PGE2的含量及细胞内COX-1和COX-2的活性.结果:Ⅷ因子抗体免疫组化染色可见90%以上的培养细胞呈阳性,确认为rCMEC.暴露于30ng·mL-1 IL-1后,rCMEC内COX-2活性及释放的PGE2量显著增加,COX-1活性变化无统计学差异.加入不同含量的邻甲氧基桂皮醛后,随含量增加可下调COX-1,COX-2活性及PGE2量,且呈剂量依赖关系;至含量为200μg·mL-1时,COX-2活性及释放的PGE2与IL-1单独作用组相比均有显著性差异,COX-1活性虽有所降低,但无统计学上的显著差异.结论:邻甲氧基桂皮醛能下调IL-1刺激rCMEC释放升高的PGE2,作用机制可能与抑制COX-2活性有关.
-
脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型的建立及牛胆酸的保护作用
目的:建立脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型,并观察了牛胆酸对其影响.方法:体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,以氧糖剥夺(Krebs液)再复氧复糖模型模拟缺血再灌注损伤,并用牛胆酸进行了干预,用MTT比色法测定A值代表细胞生存活性.结果:氧糖剥夺4 h再复氧复糖12 h可造成培养大鼠脑微血管内皮细胞损伤,牛胆酸干预后A值明显高于模型组(P<0.01).结论:牛胆酸可显著减轻脑微血管内皮细胞体外模拟缺血再灌注细胞损伤.
-
黄连解毒汤有效成分对缺氧-复氧时脑微血管内皮细胞VCAM-1表达的影响
目的:研究栀子苷、黄芩苷和小檗碱对缺氧.复氧损伤时大鼠脑微血管内皮细胞的保护机制.方法:建立离体大鼠脑微血管内皮细胞缺氧4 h复氧12 h损伤模型.用0.128,0.064,0.032 μmol·mL-1栀子苷,0.028,0.014,0.007 μmol.mL-1黄芩苷和0.024,0.012,0.006 μmol·mL-1小檗碱分别作用于损伤的细胞,采用免疫细胞化学方法和图象定量分析技术,检测平均吸光度和平均面积,比较各组血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)蛋白表达的变化;采用RT-PCR方法检测并比较各组VCAM-1 mRNA表达的变化.结果:模型组VCAM-1蛋白表达的平均吸光度值和平均面积以及VCAM-1 mRNA表达显著高于正常组(均P<0.01).所有给药组的平均吸光度值和平均面积均低于模型组,差异有统计学意义(均P<0.01).0.007 μmol·mL-1黄芩苷组、0.012,0.006 μmol.mL-1小檗碱组的平均吸光度值较正常组高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.01),其余各给药组与正常组的差异无统计学意义.0.014 μmol.mL-1黄芩苷组平均面积高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),其余各给药组与正常组的差异无统计学意义.各给药组mRNA表达高于正常组且低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:栀子苷、黄芩苷和小檗碱等黄连解毒汤有效成分能够保护缺氧-复氧损伤的大鼠脑微血管内皮细胞,其保护机制之一是抑制VCAM-1的表达.
