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LC-MS测定大鼠脑微血管内皮细胞中卡马西平的含量
目的:建立大鼠脑微血管内皮细胞中卡马西平的LC-MS测定方法.方法:细胞悬液中加入内标盐酸非洛普,高速离心沉淀蛋白,取上清液进行LC-MS测定.色谱柱为Shim-pack ODS C18(5.0 μm,150 mm×2.0 mm ID),离子源为ESI,检测离子为[M+H]+:卡马西平(m/z):237;DDPH(m/z):344,流动相为2 mmol/L醋酸铵缓冲液(pH=4)与乙腈(60∶40,v/v).结果:本实验条件下卡马西平与内标盐酸非洛普可良好分离,保留时间分别为5.0 min和3.6 min左右;线性范围为0.39～50.00 ng/mL;方法回收率为96%～104%;日内日间变异系数均小于13%;低检测浓度为0.39 ng/mL.结论:该方法符合生物样品测定要求,可用于细胞内卡马西平浓度的测定.
关键词： 卡马西平 高效液相色谱-质谱法 脑微血管内皮细胞 -
白细胞介素1β刺激脑微血管内皮细胞内15-羟基前列腺素脱氢酶的经时变化
目的:探讨白细胞介素1β(IL-1β)刺激体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC)15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)活性的经时变化.方法:建立rCMEC培养方法,进行Ⅷ因子相关抗原鉴定.待细胞长至融合状态后,以30 ng/ml浓度的IL-1β分别刺激0.5、1、2、4、8、12、24 h,以放射免疫法测定各刺激时间点15-PGDH活性.结果:90%以上的培养细胞呈阳性,确定为rCMEC.加入IL-1β刺激后2 h,细胞内15-PGDH活性与未刺激组比较有显著性差异(P＜0.05);12h时达到大值;24h时有所降低,但与未刺激组比较仍具显著性差异(P＜0.01).结论:rCMEC经IL-1β刺激后,细胞内15-PGDH活性经历一个逐渐升高,到达峰值后缓慢下降的过程,IL-1β刺激12 h内皮细胞15-PGDH活性达峰值.
关键词： 白细胞介素1β 脑微血管内皮细胞 15-羟基前列腺素脱氢酶 -
白细胞介素1β刺激脑微血管内皮细胞释放前列腺素E2的经时变化
目的:探讨白细胞介素1β(IL-1β)刺激体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞释放前列腺素E2(PGE2)的经时变化. 方法:30 ng/ml浓度的IL-1β刺激体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞,分别于刺激后0.5、1、2、4、8、12和24 h收集细胞外液,用酶联免疫法(ELISA)测定各时间点细胞外液PGE2含量,并对各相应时间点的内皮细胞进行细胞计数. 结果:①空白组内皮细胞计数值随时间延长而持续性增加,12 h趋于稳定;IL-1β刺激组细胞计数值随时间延长也相应增加,12 h基本趋于稳定,虽各时间点细胞数绝对值略少于空白组,但两者无统计学差异(P>0.05). ②由于细胞的不断生长,空白组PGE2含量也在不断地增加,12 h 为(10.80±1.46) pg/ml,达大值,24 h为(9.72±2.78) pg/ml,有所下降.加入IL-1β刺激后8 h,细胞外液PGE2含量已开始明显增加,12 h 为(16.93±2.98)pg/ml,达大值,与空白组比较,有显著性差异(P<0.01);24 h为(16.82±1.54)pg/ml,虽有所降低,但与空白组比较,仍具显著性差异(P<0.01). 结论:大鼠脑微血管内皮细胞经IL-1β刺激后,细胞释放的PGE2在12 h达峰值,以后缓慢下降.
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石杉碱甲保护人脑微血管内皮细胞损伤的体外实验研究
目的 体外实验研究石杉碱甲对人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)损伤的保护作用和机制.方法 在培养的HBMEC上,利用丙酮醛诱导细胞损伤,通过MTT检测细胞活力,LDH、SOD活性试剂盒及caspase-3活性试剂盒检测细胞损伤情况,观察石杉碱甲的作用和机制.结果 石杉碱甲呈浓度依赖地保护MGO诱导的细胞损伤,在10-5 mol·L-1时呈大保护作用.丙酮醛能诱导HBMEC的SOD活性下降,而石杉碱甲(10-6,10-5mol·L-1)能逆转这种作用.进一步研究发现石杉碱甲能抑制丙酮醛诱导的caspase-3活性上升.结论 石杉碱甲对丙酮醛诱导的HBMEC的损伤具有保护作用,这可能与其抗自由基和抗凋亡作用有关.
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丹酚酸A对H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞氧化损伤保护的实验研究
目的 观察丹酚酸A对H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞(RCMECs)氧化损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法 分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞,用H2O2损伤的方法建立氧自由基损伤模型.采用丹酚酸A进行干预后,分别测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、血栓素B2(TXB2)水平、6-酮基前列腺素1α(6-keto-PGF1 α)的含量,以及细胞内和培养液中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性.结果 H2O2致RCMECs氧化损伤后,细胞LDH释放水平、TXB2和MDA的含量均明显增加,同时6-keto-PGF1 α含量和SOD活性显著下降;而丹酚酸A预处理后能呈浓度依赖性的降低RCMECs氧化损伤后LDH水平、TXB2含量和细胞内外的MDA含量,提高受损细胞6-keto-PGF1 α的表达和细胞内外SOD活性.结论 丹酚酸A对H2O2所致RCMECs氧化损伤具有保护作用,其机制可能与其抗氧化作用有关.
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华佗再造丸中单体成分的细胞保护活性研究
目的:鉴定华佗再造丸中具有细胞保护作用的化合物.方法:采用PC12细胞和小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)氧化损伤和缺糖缺氧再灌注(OGR)损伤模型测定,从中得到的72种单体成分中具有细胞保护活性和促神经细胞增殖活性的化合物.结果:可提高氧化损伤的PC12细胞存活率的化合物有槲皮素和异鼠李素;可提高OGR损伤的PC12细胞存活率的单体有异甘草素、3-咖啡酰奎尼酸和人参皂苷Rb1.可促进正常PC12细胞增殖的单体化合物有人参皂苷Rg2、胆酸钠等8种化合物.可提高氧化损伤的bEnd.3细胞存活率的单体有槲皮素、芍药苷等6种化合物.可提高OGR损伤的bEnd.3细胞存活率的单体有槲皮素、人参皂苷Rg1等6种化合物.结论:除槲皮素对不同细胞不同损伤模型细胞均有保护作用,为广谱细胞保护剂外,其余化合物均有一定的细胞选择性或模型选择性保护作用,对神经细胞增殖有促进作用的化合物未见有细胞保护作用.这些结果为华佗再造丸治疗脑血管疾病提供了进一步的药理学依据.
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桂枝汤有效部位A对IL-1刺激的大鼠脑微血管内皮细胞前列腺素E2及其主要信号转导元件的影响
目的:探讨桂枝汤解热有效部位A(Fr.A)对IL-1刺激的大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC)PGE2信号转导通路主要元件的影响.方法:制备大鼠含药血清,通过放射免疫法测定PGE2含量,酶反应底物法测定PLA2活性,ELISA法测定COX活性,比色法测定NO含量.结果:Fr.A含药血清处理rCMEC后,在IL-1刺激下,孵育液中PGE2和NO含量、总COX和COX-2活性均显著减低,对升高的sPLA2活性无明显影响.结论:Fr.A可通过影响PGE2信号转导通路主要元件COX及NO,进而影响PGE2水平.
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姜黄素抑制TNF-α诱导的BMEC与白细胞的粘附
目的 研究姜黄素(curcumin)对脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelium cell,BMEC)和白细胞粘附的影响.方法 采用髓过氧化酶法测定经肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激的BMEC对白细胞的粘附;以RT-PCR和Western blot方法检测在TNF-α作用下BMEC表面ICAM-1表达.结果 经TNF-α刺激的BMEC明显增加其与白细胞的粘附反应;curcumin(12.5～100 mg·L-1)可剂量依赖性地抑制TNF-α所诱导的BMEC与白细胞的粘附;在TNF-α刺激前30 min加入curcumin可抑制BMEC的ICAM-1表达.结论 curcumin对TNF-α所致的BMEC损伤具有保护作用,该作用可能是curcumin下调ICAM-1表达,抑制BMEC与白细胞的粘附,从而保护内皮细胞免受损伤.
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三七总皂苷对抗H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞损伤的物质基础研究
目的 研究三七总皂苷对H2O2致大鼠脑微血管内皮细胞损伤产生保护作用的物质基础.方法 分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞(RBMEC),以MTT和LDH的释放为指标,观察三七总皂苷(TPNS)、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1对RBMEC损伤的保护作用.结果 500 μmol·L-1的H2O2对原代培养的RBMEC产生明显的损伤.20～200 mg·L-1的TPNS,16.0 μmol·L-1的R1,37.5～75.0 μmol·L-1的Rg1,8.0～16.0 μmol·L-1的Rd及5.4～54.0 μmol· L-1的Rb1对H2O2致RBMEC的损伤具有明显的保护作用(P＜0.05或P＜0.01),Re则无此作用.结论 TPNS对H2O2所致原代培养的RBMEC损伤具有明显的保护作用,产生这一作用的主要物质基础可能为Rb1、Rg1和Rd.
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梓葛冻干粉针抗脑神经血管单元炎症及氧化损伤
由梓醇和葛根素配伍制成的抗缺血性中风新药--梓葛冻干粉针( injection of lyophilized powder with catalpol and puerarin, C-P),可透过血脑屏障并且是安全的[1-2],可明显减少中风模型小鼠大脑梗死灶面积[3]。本研究在体外构建神经血管单元(neurovascular unit, NVU)模型并作氧糖剥夺再灌注( oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R )损伤[4],观察C-P对NVU的整体保护作用,探讨其抗炎和抗氧化机制,为C-P治疗缺血性中风提供科学依据,也为缺血性中风的治疗药物筛选提供一种多细胞体外研究模式。
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灯盏花素对大鼠脑微血管内皮细胞 OGD 损伤的保护作用及机制研究
灯盏花素（breviscapine，Bre）是从短亭飞蓬中提取的黄酮类化合物，具有保护缺血性脑血管疾病、调节血管内皮功能、减轻炎性反应等作用［1］。本实验通过分离培养大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs），建立氧糖剥夺（OGD）BMECs 模型，研究 Bre 对 BMECs 损伤是否具有保护作用，并探讨其可能的机制。相关研究尚未见报道。
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大鼠脑微血管内皮细胞与周细胞、星形胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型
目的：应用原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞（brain-microvessel endothelial cells，BMECs ）与脑微血管周细胞（brain-microvessel pericytes，BMPC ）、星形胶质细胞（astro-cytes，AS）共培养建立可模拟在体状态的体外血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）模型。方法原代分离、纯化和培养大鼠BMECs、BMPC和AS，通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞，应用Millicell细胞培养插（孔径0.4μm）建立5种不同类型的体外BBB模型，经跨内皮电阻值（transendothelial electrical resistance，TEER）、荧光素钠通透性（sodium fluorescent，Na-FLU ）、碱性磷酸酶（AKP）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT1）的表达测定以及阳性药在体内和体外BBB通透量的相似性，比较评价其屏障功能。结果原代培养的BMECs呈典型的铺路卵石样结构，BMPC胞体较大且呈分枝状，AS 有细长突触，胞质较浅；免疫细胞化学染色证实原代细胞为目标细胞；BMECs与BMPC、AS共培养后TEER值可达（478±25）Ω·cm2，Na-FLU 的表观渗透系数为[（8.23±0.78）×10－6]cm·s－1，AKP和γ-GT1表达分别为（6.90±0.27）金氏单位· g－1 Pro，（4.39±0.32）μg·g－1 Pro；阳性药在体外BBB的表观渗透系数（apparent permeability coefficient，Papp ）与在体数据具有较好的相关性（R2＝0.92）。结论原代培养的大鼠BMECs与BMPC、AS共培养建立的体外BBB模型在形态、结构及屏障功能方面具备BBB的基本特征，为研究BBB的生理学、病理学以及筛选化合物提供了一种有用工具。
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一种高纯度和高活力的大鼠脑微血管内皮细胞的提取及原代培养方法
目的：建立一种纯度和活力较高、简单实用的大鼠脑微血管内皮细胞分离及原代培养方法,为建立体外血脑屏障提供材料。方法采集1-2周SD大鼠大脑皮质,应用Ⅱ型胶原酶和分散酶/胶原酶连续消化法,筛网过滤法及20%BSA和44%Percoll两次梯度离心法获得脑微血管段后,接种于培养瓶中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察,以Ⅷ因子相关抗原免疫染色法对其进行鉴定。结果体外培养2h后,微血管内皮细胞爬出血管段进行贴壁生长,3~4 d呈典型的铺路卵石样结构,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测内皮细胞表达呈阳性,可见细胞胞质呈棕色,阳性细胞占99%以上。结论该方法能成功地分离并培养出高纯度的大鼠脑微血管内皮细胞,对体外血脑屏障的建立以及脑微血管内皮细胞的生物学特性和功能的深入研究具有重要意义。
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脑微血管内皮细胞的原代培养方法概述
脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)是构成血脑屏障的主要成分,与脑水肿、脑缺血以及脑肿瘤等脑血管疾病的发生、发展密切相关.BMECs原代培养模型已被广泛应用于血脑屏障、脑血管疾病的病理、生理及分子生物学研究.该文对近年来国内外有关BMECs原代培养的方法进行综述,为脑血管疾病的研究提供基础.
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通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用
目的 通过观察通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性的影响,以及对血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)及其受体内皮特异性酪氨酸激酶受体-2(endothelial-specific tyrosine kinase receptor 2,Tie-2)表达的影响,以评价其对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用.方法 利用氧糖剥夺方法复制人脑微血管内皮细胞拟缺血损伤模型,通络救脑注射液及其有效成分分别作用不同时间后,采用四甲基偶氮唑盐染色法测定细胞活性,采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率检测细胞损伤程度,采用蛋白印迹法检测内皮细胞Ang-1和Tie-2表达水平.结果 通络救脑注射液可显著提高拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性,降低LDH漏出率,增加内皮细胞Ang-1和Tie-2的表达,两个有效成分发挥疗效的时间有所不同,复方注射液作用明显优于两个有效成分.结论 通络救脑注射液对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞具有保护作用,其机制与增加Ang-1及其受体Tie-2表达有关,显示中药组方可发挥整合调节的治疗优势.
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尼莫通在急性脑外伤及脑手术后的应用(附75例分析)
尼莫通治疗脑损伤脑缺血主要是通过对神经细胞和脑微血管内皮细胞膜上钙通道的特异性阻滞作用,从而减轻神经细胞坏死而实现,此药尚能选择性地扩张发生痉挛的胸血管,改善支配区的血流,促进脑康复.本文报道尼莫通在急性脑外伤及脑手术后的应用.
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Nod样受体蛋白3炎性体在2型糖尿病脑微血管内皮细胞中的变化及变化机制
目的 探讨Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎性体在2型糖尿病脑微血管内皮中的变化及机制.方法 3月龄Wistar大鼠和自发性2型糖尿病(GK)大鼠各5只,采用免疫组织化学法观察NLRP3在脑组织中的表达;体外培养小鼠脑微血管内皮细胞(CMEC).不同糖浓度培养基模拟2型糖尿病内环境,活性氧(ROS)阻断剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为抑制剂,将细胞分为对照组(糖浓度5.6 mmol/L)、高糖1组(HG1组,培养基糖浓度10 mmol/L)、高糖2组(HG2组,培养基糖浓度20 mmol/L)、高糖3组(HG3,培养基糖浓度30 mmol/L)及高糖+NAC组(HG+NAC组,目的蛋白表达较明显组的糖浓度).采用Western blotting法检测各组硫氧还蛋白交互蛋白(TXNIP)和NLRP3的表达,并对TXNIP和NLRP3是否存在相关性进行分析;采用ELISA法检测白介素1β(IL-1β)的含量;采用流式细胞术检测对照组、HG3组、HG+ NAC组ROS的含量.结果 NLRP3在脑微血管壁聚集,与Wistar大鼠相比,GK大鼠的阳染强度,阳染血管数均有增加(P＜0.05);与对照组相比,HG1组、HG2组、HG3组TXNIP、NLRP3的表达增加(P＜0.01),HG3组明显,细胞内IL-1β水平增高(P＜0.01),ROS的含量增加(P＜0.01);细胞内TXNIP和NLRP3的表达呈正相关性(r=0.993;P＜0.05);给予ROS清除剂后,与HG3组相比,HG+NAC组细胞内ROS含量下降(P＜0.01),TXNIP、NLRP3表达水平下降(P＜0.01),细胞内IL-1β水平下降(P＜0.01).结论 NLRP3在2型糖尿病脑微血管内皮细胞中经ROS-TXNIP途径被激活,并且促进炎性因子IL-β的释放,在2型糖尿病脑微血管损伤中发挥重要作用.
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非诺贝特对人BMEC与小鼠脑微血管组织SOD3表达的影响及机制
目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体 α亚型(PPARα)激动剂非诺贝特对人脑微血管(BMEC)与小鼠脑微血管组织细胞外铜/锌超氧化物歧化酶(SOD3)表达的调节作用及其机制.方法 将培养好的BMEC随机分为两部分,分别加入终浓度为10μg/mL非诺贝特、同等体积的DMSO处理12 h;将15只小鼠随机分为两部分,分别给予30 mg/kg非诺贝特、10%的羧甲基纤维素混悬液10 mL/kg连续灌胃7 d,处死小鼠取脑组织,提取脑微血管;用RT-PCR技术检测BMEC与脑微血管组织内过氧化物酶体增殖物激活受体 α亚型(PPARα)、SOD3的mRNA表达.构建含SOD3启动子荧光素酶报告质粒pGL4 mSOD3,用突变试剂盒定点获得过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)序列突变的荧光素酶报告质粒pGL4 mu mSOD3,将pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3转染BMEC 24 h,取部分细胞用终浓度10μg/mL的非诺贝特处理12 h,检测细胞荧光素酶活性.结果 经非诺贝特处理后,BMEC及小鼠脑微血管组织中PPARα、SOD3 mRNA表达均升高(P均<0.05).转染pGL4 mSOD324 h,经非诺贝特处理后BMEC内pGL4 mSOD3的荧光素酶活性增强(P<0.05);转染pGL4 mu mSOD324 h,经非诺贝特处理的BMEC荧光素酶活性变化不明显(P>0.05).结论 非诺贝特通过激活PPARα从而调节人BMEC与脑微血管组织中SOD3的表达.
关键词： 非诺贝特 细胞外铜/锌超氧化物歧化酶 脑微血管 脑微血管内皮细胞 小鼠 -
体外血脑屏障的建立
目的：利用大鼠脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞于体外建立血脑屏障。方法分别取10只出生7～10 d、2只出生1～3 d的SD大鼠，断头处死后取脑组织，分别分离培养脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞，采用免疫细胞染色方法鉴定脑微血管内皮细胞，以脑微血管內皮细胞因子Ⅷ作为标记抗原，以神经胶质原纤维酸性蛋白（ GFAP）作为标记抗原鉴定星型胶质细胞。以非接触方式共培养脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞的方法建立体外血脑屏障。接种12 d将电极插入待测Transwell小室（培养模型）、细胞培养液、空白Transwell小室（细胞培养液为媒介）。测定跨膜电阻、测算荧光素钠渗透系数（ Pe），衡量模型完整性。结果接种12 d时，模型、细胞培养液、空白Transwell小室的电阻值分别为180、64、112Ω／cm2。接种12 d时模型Pe为（4．67±0．4）×10－6 cm／s。结论成功建立体外血脑屏障，屏障效应较好、完整性较高。
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通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用
目的:观察通心络对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用.方法:分离大鼠脑微血管内皮细胞培养鉴定,采用氧糖剥夺法建立模拟体外脑缺血再灌注内皮细胞损伤模型,利用制备的通心络含药血清干预,CCK-8法检测细胞活性;硝酸酶还原法测定细胞上清液NO的含量;Elisa法检测细胞上清液vWF的含量.结果:与正常组比较,模型组细胞OD值明显降低(P＜0.01),细胞上清液NO和vWF(P ＜0.05或P＜0.01)含量明显升高;与模型组比较,10％的通心络含药血清作用24h,细胞OD值明显增高(P＜0.01),细胞上清液NO含量和vWF含量明显降低(P均＜0.01).结论:通心络含药血清可能是通过减少NO和vWF分泌保护脑缺血再灌注损伤的脑微血管内皮细胞.
