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脑缺血损伤ActA与跨膜受体ActRⅡA在Smads转导通路中的表达
目的 探讨脑缺血损伤ActA/Smads通路主要位点基因表达在信号转导中的作用及其机制.方法 建立PC12细胞神经元氧糖剥夺(OGD)体外脑缺血模型,应用Real-time PCR技术,检测OGD3h、6h、9h、12h、16h、24h ActA及其受体ActRⅡA和下游Smad3 mRNA表达变化.结果 OGD3h PC12细胞ActβA、ActRⅡA及Smad3 mRNA表达均显著升高且达高峰；OGD6h ActβA mRNA表达有所降低并呈逐渐下降趋势；OGD6h ActRⅡA表达开始下降,但其下降趋势弱于ActβA,在OGD9h仍高于正常对照组,OGD24h达低点；OGD6hSmad3 mRNA表达也开始下降,但其下降趋势弱于ActRⅡA,在OGD16h仍高于正常对照组,OGD24h达低点(组间比较P＜0.05).结论 ActA/Smads通路的活性随OGD时间呈动态变化,短时程OGD可能通过诱导神经元跨膜受体ActRⅡA的上调激活该信号转导通路.
关键词： OGD ActA/Smads 通路 smad3 -
缺氧所致海马神经元N-甲基-D-天冬氨酸2B受体和PTEN基因的表达
目的 探讨OGD缺氧损伤后大鼠海马神经元NR2B受体和抑癌基因PTEN的表达量,以及NR2B与PTEN是否有生理性相互作用关系,为研究PTEN基因在脑缺血中的保护作用机制奠定基础.方法 建立海马神经元体外OGD损伤模型,采用细胞比色分析(colorimetric assay)法和Western blotting检测神经元NR2B含量,RT-PCR和Western blotting测定PTEN基因的mRNA和蛋白表达水平,免疫沉淀和Western blotting研究NR2B与PTEN的相互作用.结果 细胞比色分析和Western blotting结果显示神经元有大量NR2B表达,OGD损伤72h后NR2B含量表达量明显减少(P<0.05);Western blotting和RT-PCR结果显示OGD损伤后PTEN表达量略有下降但尚无统计学意义(P>0.05),免疫沉淀显示mN与NR2B在物理上连接形成复合物.结论 海马神经元膜表面NR2B含量丰富,PTEN基因在海马神经元里有表达,OGD缺氧损伤再灌注引起NR2B受体和PTEN基因表达量下降,PTEN与NR2B有生理性相互作用.
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雷帕霉素对PC12细胞氧糖剥夺损伤的保护作用
目的 探讨雷帕霉素对PC12细胞氧糖剥夺损伤(oxygen and glucose deprivation,OGD)的作用.方法 选取处于对数生长期的PC12细胞,分为正常组、OGD组、溶剂组和1 nmol、10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素组,OGD同时给予雷帕霉素处理,8 h后通过倒置显微镜观察细胞形态学的变化、MTT法检测细胞存活率的变化以及LDH活性检测细胞受损程度.结果 与正常组相比,单纯OGD组细胞活性明显下降,且具有统计学意义(P<0.05);与溶剂组相比,1、10、100、500 nmol雷帕霉素组细胞存活率均存在不同程度的增高,其中10、100、500 nmol组具有统计学意义(P<0.05).结论 雷帕霉素对PC12细胞OGD损伤具有保护作用.
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NBP对器官型脑片糖氧剥夺模型中细胞凋亡的影响
目的 观察正丁基苯酞(NBP)对乳大鼠大脑皮质器官型脑片的氧糖剥夺模型(OGD)中细胞凋亡和线粒体电位的影响.方法 建立SD乳鼠大脑皮质运动区的器官型脑片,SMI-32染色观察锥体细胞.2 w后,随机分为对照组(C组)和实验组(T组),T组在OGD干预30 min后给予不同剂量NBP,分为T0、T001、T01、T1、T10组,给NBP前和后1h观察PI染色;选择T0组、T10组,观察两组在OGD 30 min、NBP 1 h、24h、72 h、7d等不同时间点PI染色变化.于NBP后1h各T组进行JC-1线粒体膜电位检测.结果 器官型脑片OGD 30 min给予NBP 1 h后,C组和各T组PI染色可见不同亮度红色荧光,各T组荧光强度均大于C组,荧光强度与NBP浓度(0～ 10 μmol/L范围内)呈负相关,各T之间组及与C组相比差异有显著性(P＜0.05);T0组和T10组在OGD 30 min均出现明显细胞凋亡,两组无显著性差异.复氧复糖后随时间延长T0组细胞凋亡增加,T10组逐渐减少,差异显著(P＜0.05);C组和各T组JC-1线粒体检测试剂盒染色可见OGD 30 min,复氧复糖1h后,红色荧光/绿色荧光(R/G)的值明显减小,R/G的值与NBP浓度呈正相关,各T组R/G值均小于C组,差异显著(P＜0.05).结论 OGD模型可模拟缺血性脑损伤的病理变化,重复性良好;NBP对缺血性脑损伤导致的急性和迟发性细胞凋亡均具有保护作用;NBP对脑片损伤后线粒体电位的耗散有阻止作用,且与剂量相关.
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器官型脑片培养 OGD 复氧复糖模型中丁苯酞对于 bcl-2／bax、及 bim 蛋白的调节作用
目的：观察正丁基苯酞（NBP）对乳大鼠大脑皮质器官型脑片的氧糖剥夺模型（OGD）中细胞凋亡bcl-2、bax及bim蛋白的调节作用。方法用生后7 d的SD乳大鼠制备大脑皮质运动区器官型脑片，将培养2 w的脑片随机分为对照组（ C组）、模型组（ M组）、溶剂对照组（ Sc组）和实验组（ T组），T组在OGD干预30 min后给予NBP 10μM。将脑片制备OGD模型30 min，部分脑片在NBP干预前后不同时间点（0 h、1 h、24 h、72 h）进行PI染色；部分脑片在NBP干预后6 h用戊二醛固定，做石蜡切片，行HE染色及bcl-2、bax、bim免疫组化染色。结果 PI染色可见C组在不同时间点荧光强度无明显变化， M组、Sc组和T组荧光强度均随时间有不同程度增强， M组和Sc组各时间点荧光强度无明显差异，T组荧光强度较前两者降低，随时间延长，降低幅度增大，尤其是72 h时间点。HE染色C组可见皮质运动区特有的大锥体细胞，结构清晰， M组和T组可见细胞肿胀，细胞核溶解， M组相对明显。免疫组化染色可见在3种染色中M组和T组阳性细胞数均较C组增多，其中bcl-2染色中T组阳性细胞增多更明显，bax和bim染色中M组阳性细胞增多更明显，3种染色中C、M、T各组之间差异均有统计学意义。结论NBP对OGD后的细胞损伤具有保护作用，可能是通过对bcl-2、bax以及bim蛋白的调节减少细胞凋亡。
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KCa3.1通道参与调控星形胶质细胞糖氧剥夺诱导的内质网应激
目的:研究KCa3.1在糖氧剥夺诱导的原代星形胶质细胞内质网应激(ERS)中的调控作用.方法:通过构建原代星形胶质细胞糖氧剥夺(OGD)模型,应用cck-8法、免疫荧光技术、western blotting等分子生物学技术研究KCa3.1在OGD引起的原代星形胶质细胞内质网应激中的作用.结果:OGD4h处理后星形胶质细胞内KCa3.1的表达明显上调.OGD处理后星形胶质细胞的细胞活力显著性降低,且具有时间依赖性.给予KCa3.1通道抑制剂TRAM-34可提高OGD 4 h处理后星形胶质细胞的细胞活力,并具有剂量依赖性.OGD处理0.5 h、1h、3h、4h、6h后,原代星形胶质细胞内ERS信号通路被激活,GRP78、p-eIF-2α的表达显著性上调.给予KCa3.1通道抑制剂TRAM-34后,OGD引起的星形胶质细胞内GRP78、p-eIF-2α的上调幅度显著性降低.结论:KCa3.1通道参与了星形胶质细胞内OGD引起的内质网应激通路的激活.
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新生大鼠海马脑片OGD模型中HO-1对NGB的影响
目的 观察HO对脑红蛋白(HGB)的影响,探索NGB的调控机制.方法 体外培养新生SD大鼠海马脑片,用HO-1促进剂Hemin和抑制剂Znpp干预后建立OGD模型.用HE、尼氏染色和免疫组化法观察OGD模型中神经元和星形胶质细胞的状态及HO-1和NGB表达的变化.结果 ①加入Hemin后,HE及尼氏染色示,神经元和星形胶质细胞与正常培养的海马脑片比较变化不大,仅有轻微的水肿.免疫组化示,HO-1和NGB的表达均增加.②加入Znpp后,HE及尼氏染色示,神经元和星形胶质细胞结构模糊,存在广泛水肿、变性、坏死.免疫组化示,HO-1和NGB的表达下降.结论 HO-1和NGB呈同步变化,提示两者可能存在相关性.NGB对神经元和星形胶质细胞具有保护作用.
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小鼠脑片损伤和保护药物的定量评价方法
目的:建立小鼠离体脑片损伤及保护药物作用的定量评价方法.方法:小鼠脑片以缺氧/缺糖(OGD)或N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)诱导损伤后,用2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色,然后以图像分析方法计算TTC染色平均灰度和面积,并观察氯胺酮的保护作用.结果:纹状体和皮层TTC染色平均灰度和面积随OGD时间的延长而下降,在7.5～15 min时明显下降;OGD后再灌30 min TTC染色平均灰度可暂时增高,然后又下降.NMDA 10～100 μmol/L显著降低TTC染色平均灰度.氯胺酮(10 μmol/L)能减轻OGD或NMDA对脑片的损伤.结论:小鼠离体脑片TTC染色平均灰度和面积可定量评价急性脑损伤,并能用于评价药物的保护作用.
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一种定量评价离体海马脑片缺糖/缺氧损伤的新方法
目的:建立一种定量评价离体脑片缺糖/缺氧损伤的简便、快速、灵敏的方法.方法:离体海马脑片缺糖/缺氧不同时间后以2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色,用乙醇∶二甲亚砜(50∶50)抽提TTC红色结晶产物,分光光度法测定OD490值,并与LDH释放率进行比较.结果:随着缺糖/缺氧时间的延长,TTC染色(OD490值)逐渐下降,而LDH释放率逐渐上升,两结果呈负相关(r =-0.933,P<0.01),提示脑片缺血性损伤.尼莫地平、地塞米松和氯胺酮可减轻脑片缺血性损伤,但ONO-1078无效.结论:TTC染色法简单易行,且客观灵敏,可用于离体脑片损伤的评价及药物初筛.
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西红花苷对缺氧复氧损伤的SH-SY5Y细胞线粒体动力学的影响
目的：探讨西红花苷对缺氧缺糖（ oxygen-glucose dep-rivation，OGD）损伤的人神经母细胞瘤细胞（ SH-SY5Y）线粒体的保护作用及可能的机制。方法 SH-SY5Y细胞OGD损伤同时给予药物，4 h后复氧2 h，测定线粒体膜电位、胞内钙离子浓度；免疫荧光、免疫印迹法检测细胞线粒体 Drp1、Opa1、Mfn1、Mfn2含量变化。结果 SH-SY5Y细胞缺氧后线粒体膜电位明显降低，胞内钙离子浓度升高；西红花苷明显提高OGD损伤引起的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位，降低胞内钙离子浓度，抑制Drp1表达量，上调Opa1表达量。结论西红花苷对OGD损伤的SH-SY5Y细胞具有明显的保护作用，恢复其线粒体功能，起保护作用机制可能与抑制线粒体分裂融合异常有关。
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青藤碱对大鼠海马神经元缺血损伤的保护作用
目的：观察青藤碱( sinomenine,SN)对氧糖剥夺( oxy-gen glucose deprivation,OGD)诱导海马神经元缺血损伤的保护作用并探讨其机制。方法原代培养海马神经元OGD 2 h后复灌24 h(OGD-R),MTT法和LDH试剂盒分别检测各组细胞存活率和乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase,LDH)释放量；Hoechst染色检测细胞凋亡；Westren blot 检测凋亡相关蛋白表达；荧光钙离子成像系统检测[ Ca2+] i ,全细胞膜片钳技术记录酸敏感离子通道( acid-sensing ion channels, ASICs)电流。结果不同浓度SN均能抑制OGD-R诱导的海马神经元存活率降低和LDH释放增多； SN能明显抑制OGD-R诱导的神经元凋亡、Bcl-2/Bax比值的下降、caspase-3表达的增加以及胞内钙浓度升高, SN还能抑制海马神经元ASIC1a电流,也能抑制OGD诱导的ASICs电流增加。结论SN对 OGD诱导海马神经元损伤有保护作用,其机制可能与抑制ASICs通道减轻钙超载相关。
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灯盏花素对大鼠脑微血管内皮细胞 OGD 损伤的保护作用及机制研究
灯盏花素（breviscapine，Bre）是从短亭飞蓬中提取的黄酮类化合物，具有保护缺血性脑血管疾病、调节血管内皮功能、减轻炎性反应等作用［1］。本实验通过分离培养大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs），建立氧糖剥夺（OGD）BMECs 模型，研究 Bre 对 BMECs 损伤是否具有保护作用，并探讨其可能的机制。相关研究尚未见报道。
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大脑皮层神经元原代培养方法的改良及一种体外缺氧缺糖简易模型的建立
目的 改进SD胎鼠大脑皮层神经元体外原代培养方法及其一种缺氧缺糖(OGD)简易模型建立.方法 用温和的TrypLE胰酶消化得到单个皮层神经细胞,用含有B27的Neurobasol培养基进行培养.培养7d后,将其培养液换成无糖DMEM培养液,放入缺氧装置中分别培养4、5及6h,利用MTT法检测细胞存活率,并用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH的释放量.结果 分离和培养的神经元生长状态良好,免疫荧光方法证明该方法培养的大脑皮层神经元纯度可达到(93.2±1.3)％,能够达到实验研究的要求.细胞OGD4、5及6h后,细胞存活率分别为(52.7±1.3)％、(26.5±3.3)％及(20.8±1.1)％:LDH的释放量分别为(52.9±4.8)％、(89.3±1.3)％及(93.2±11)％.结论 改良后的培养方法能够稳定地获得高纯度的SD胎鼠大脑皮层神经元,用厌氧发生装置替代三气培养箱建立了一种OGD简易模型,同时选择OGD4h作为缺氧缺糖模型佳时间点.
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哈巴苷对缺氧缺糖诱导下大鼠海马神经细胞游离Ca2+浓度的影响
目的:研究哈巴苷对缺氧缺糖(OGD)诱导下海马神经细胞内游离Ca2+浓度的影响.方法:原代培养新生24 h内SD乳鼠海马神经细胞,采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色鉴定并检测其纯度;哈巴苷(0.5、1、5、10、25、50、100、150、200、250、500、1 000 μmol/L)预处理48 h后,OGD 4 h,另设正常对照组及模型组,采用MTT法检测各组海马神经细胞活力,筛选哈巴苷有效浓度范围;将SD乳鼠海马神经细胞随机分为正常对照组、模型组、哈巴苷各剂量(50、75、100、125μmol/L)组,采用Fluo-3/AM负载的海马神经细胞,应用荧光倒置显微镜及荧光分光光度计观测哈巴苷各剂量对OGD海马神经细胞内游离Ca2+浓度的影响.结果:原代SD乳鼠海马神经细胞培养至第7天,经神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色鉴定为海马神经细胞,并检测其神经细胞纯度为85％～ 90％:MTT结果显示:与模型组比较,哈巴苷10、25、50、100 μmol/L能显著增强海马神经细胞的活力(P＜0.05或P＜0.01),确定哈巴苷预处理48 h的有效浓度范围为10～100 μmol/L;荧光倒置显微镜下观察,正常对照组海马神经细胞Ca2+荧光强度弱,模型组海马神经细胞Ca2+荧光强度强;与模型组比较,哈巴苷各剂量预处理48 h,均能降低OGD诱导的海马神经细胞Ca2+的荧光强度,其中75 μmol/L组荧光强度降低为明显.荧光分光光度法测定显示:与正常对照组比较,模型组海马神经细胞内游离Ca2+浓度显著升高(P＜0.01);与模型组比较,哈巴苷75 μmol/L能显著降低OGD诱导下海马神经细胞内游离Ca2+的浓度(P＜0.05).结论:哈巴苷预保护48 h能降低OGD诱导的海马神经细胞内游离Ca2+的浓度,以75 μmol/L剂量效果好,其保护作用与降低细胞内游离Ca2+浓度有关.
