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GDF-5基因活化基质体内转染修复兔退变椎间盘的实验研究
目的 通过GDF5基因活化基质体内转染兔退变椎间盘,观察其修复效果.方法 脂质体介导的pcDNA3.1 (+)/GDF-5重组质粒混入Ⅰ型胶原支架,置入兔退变椎间盘;实验分为GAM组,普通支架组,脂质体对照组,2个月后RT-PCR和Westem blot观察椎间盘髓核细胞GDF-5基因和蛋白表达的稳定性,间苯三酚法检测髓核蛋白多糖含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率来观察修复效果.结果 RT-PCR结果显示术后2个月GDF-5基因稳定表达.GAM组蛋白多糖含量高于另外两组(P＜0.05),空白支架组和对照组之间没有差异(P=0.601).GAM组髓核细胞凋亡率明显低于另外两组(P＜0.01),空白支架组和对照组之间没有差异(P =0.902).结论 利用GAM可以有效的进行GDF-5基因体内转染并表达,从而修复退变椎间盘.
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双基因活化纳米骨浆的体内成骨
背景：前期实验构建了骨形态发生蛋白2/血管内皮生长因子双基因活化纳米骨浆。
目的：观察骨形态发生蛋白2/血管内皮生长因子双基因活化纳米骨浆在动物体内成骨的基因表达和骨形成效果。
方法：取昆明小鼠24只，在其中12只右侧大腿后群肌袋内注入骨形态发生蛋白2/血管内皮生长因子+纳米骨浆，左侧大腿后群肌袋内注入空白质粒+纳米骨浆或纳米骨浆；在剩余12只小鼠右侧大腿后群肌袋内注入骨形态发生蛋白2+纳米骨浆，左侧大腿后群肌袋内注入空白质粒+纳米骨浆或纳米骨浆。术后2，4周取材作影像学检查、组织学观察和分子生物学检测。
结果与结论：术后各时间点骨形态发生蛋白2/血管内皮生长因子+纳米骨浆组、骨形态发生蛋白2+纳米骨浆组均有骨样组织形成；骨形态发生蛋白2/血管内皮生长因子+纳米骨浆组局部有明显骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的 mRNA 表达，并且碱性磷酸酶水平、成骨速度及新生骨量明显优于骨形态发生蛋白2+纳米骨浆组(P <0.05)；空白质粒+纳米骨浆组、纳米骨浆组无明显成骨表现。表明纳米骨浆经骨形态发生蛋白2/血管内皮生长因子质粒或骨形态发生蛋白2质粒活化后，在体内具有了一定的成骨能力，且前者在成骨速度和质量方面较后者明显增强。 -
Osx 基因活化技术促进种植体周围骨再生的实验研究
目的：观察Osx基因活化技术对种植体周围骨形成和矿化的作用。方法首先将倍骼生与pcDNA 3．1 flag-Osx按比例混合构建GAM材料。选择雄性Beagle犬15只，每只动物拔除左侧及右侧下颌第2前磨牙，用超声骨刀于拔牙创颊侧制备颊舌向5 mm、近远中向5 mm、垂直高度10 mm的骨缺损，分别植入直径3．3 mm、长度13 mm的奥齿泰GSII种植体2颗。2个骨缺损处分别填入倍骼生＋空载体pcDNA3．1flag （ A组）、倍骼生＋pcDNA 3．1flag-Osx（ B组）。应用GBR技术在材料表面覆盖Bio-gide胶原膜，缝合牙龈。分别于术后4、8、12周处死动物5只，取出标本，用Micro CT测量骨再生相关数据。结果 A、B两组术后4、8、12周比较，骨小梁间隙、骨体积分数、骨小梁的体积、骨小梁厚度差异均有统计学意义（P均＜0．05）。结论倍骼生与Osx质粒构成的基因活化材料有明显的骨诱导作用，可促进骨组织再生。
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体外培养包埋透明质酸/壳聚糖/质粒DNA纳米粒的壳聚糖支架负载软骨细胞
目的 观察包埋透明质酸(HA)/壳聚糖(CS)/质粒DNA (pDNA)纳米粒的壳聚糖支架对软骨细胞生物学性状的影响及基因转染能力,探讨其作为基因活化软骨组织工程支架的可行性.方法 构建包埋HA/CS/pDNA纳米粒的壳聚糖支架,负载兔关节软骨细胞体外培养,1～2周后通过扫描电镜、组织学、免疫组织化学、倒置相差显微镜及激光共聚焦显微镜检测支架对软骨细胞表型及功能的影响,以及基因转染的能力.结果 支架孔径为100～300 μm,孔孔隙率为(86.0±1.2)％;软骨细胞在包埋HA/CS/pDNA纳米粒的支架中贴附良好,维持表型稳定,1～2周时实验组分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原等软骨细胞外基质较对照组明显增多,1周时测得支架中的HA/CS/pDNA纳米粒介导基因转染软骨细胞并表达绿色荧光蛋白.结论 包埋HA/CS/pDNA纳米粒的壳聚糖支架细胞相容性良好,能转染培养的软骨细胞表达绿色荧光蛋白.
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两种复合阳离子聚合物/pDNA的基因活化基质转染骨髓间充质干细胞的效果比较
目的 比较2种复合阳离子聚合物/pDNA的基因活化基质转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的效果.方法 以壳聚糖/胶原复合支架为基质材料,以壳聚糖/pDNA复合物或PEI/pDNA复合物为基因传递系统,合成了2种不同的基因活化基质(gene-activated matrix,GAM).以含有裸DNA的GAM作为对照,将BMSCs种植于各组GAM中共培养7d,采用MTT法通过检测细胞的吸光度值测定细胞的增殖能力,检测各种GAM的细胞相容性;各组GAM采用共培养转染和直接转染2种方式体外转染BMSCs,通过检测萤光素酶表达水平比较各种GAM体外转染BM-SCs的能力.结果 与对照组相比,含有壳聚糖/pDNA复合物的GAM并未影响BMSCs的增殖(P＞0.05),具有良好的细胞相容性;而与含有PEI/pDNA复合物的GAM共培养的BMSCs增殖能力明显低于对照组(P＜0.05),对BMSCs具有一定的细胞毒性.采用共培养转染方式,壳聚糖/pDNA与PEI/pDNA复合物组均获得比对照组高的转染结果(1.28×10 5,1.62×105 vs.2.14×104 RLU/mg protein),但两复合物组相比差异无统计学意义(P＞0.05);采用直接转染方式,壳聚糖/pDNA组的萤光素酶表达水平与对照组相比差异无统计学意义(4.51×104vs.3.23× 104 RLU/mg protein,P＞0.05),而PEI/pDNA组的表达水平(2.50×105 RLU/mg protein)高于对照组(P＜0.05).结论 含有壳聚糖/pDNA复合物的GAM,体外共培养转染BMSCs具有较好的生物相容性及一定的转染能力,具有用于体内基因治疗的潜力.
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骨形态发生蛋白-2基因活化纳米骨浆修复兔桡骨缺损的实验研究
目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因活化纳米骨浆在损伤部位的局部成骨基因表达和骨缺损重建修复效果.方法 新西兰白兔54只,其中48只实验动物随机分成三组(每组16只32侧),制成双侧桡骨中段15 mm骨缺损模型.A组:注入hBMP-2+纳米骨浆;B组:注入空白质粒+纳米骨浆;C组:注入纳米骨浆.另6只动物制作左桡骨中段骨缺损,不植入材料,作为空白对照.术后4、8和12周取材行影像学检查、组织学观察、分子生物学检测和生物力学检测.结果 术后12周A、B和C组骨缺损均修复,A组骨缺损处有明显BMP-2的mRNA和蛋白质表达,在ALP水平、成骨速度、新生骨量及新生骨力学强度等方面均明显优于B、C两组(P《0.05).空白对照组骨缺损无愈合.结论 纳米骨浆复合BMP-2质粒后,具有一定骨诱导作用,植入体内后成骨速度、质量及力学强度较单纯的纳米骨浆明显增强,能够有效修复骨缺损.
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修复骨缺损的局部基因释放载体技术
骨骼缺损是临床上常见的问题,骨结构异常严重地影响患者的外貌、功能和心理社会行为.局部基因释放载体技术是新近开展的一种修复组织缺损的新技术.本文对该技术的发展现状及其应用于修复骨骼缺损的前景简要作一综述.
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骨髓基质干细胞复合Osx基因活化材料促进种植体周围骨再生的实验研究
目的：建立Beagle犬的种植体周围骨缺损模型，构建含有质粒pcDNA3．1 flag-Osx的基因活化基质，并与自体骨髓基质干细胞混合，观察Osx基因活化技术对种植体周围骨的形成和矿化的作用。方法：术前抽取Bea-gle犬骨髓，培养骨髓基质干细胞，扩增质粒pcDNA3．1 flag-Osx。雄性Beagle犬15只，随机分为3个组，每组5只，第1组为4周组，第2组为8周组，第3组为12周组。每只动物拔除左侧下颌第2、4前磨牙及右侧第2前磨牙，于拔牙创颊侧制备骨缺损，植入奥齿泰GSII种植体3枚，分别填入A组：倍骼生； B组：倍骼生+BMSCs+空载体pcDNA3.1flag； C组：倍骼生+BMSCs+pcDNA3.1flag-Osx。应用GBR技术，在材料表面覆盖Bio-gide胶原膜。分别于4、8、12周后处死动物，取出标本，应用影像学、组织学、组织形态计量学等手段与对照组比较。各指标用均数±标准差（X±s）来表示。应用统计软件SPSS17.0进行单因素的方差分析。 P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、硬组织观察：骨缺损处均有新骨形成。 C组多， B组其次， A组少。2、 Micro-CT数据结果显示：第1组：除骨体积分数（BVF）外，其余指标B组与A组均有显著差异（P<0.05）。骨小梁间隙（Tb.Sp.）、骨小梁数目(Tb.N)、 BVF、骨小梁的体积(BV) C组与B组间差异有显著性（P<0.05）。各指标C组与A组间差异均有显著性（P<0.05）。第2组：除BVF外，其余指标B组与A组均有显著差异（P<0.05）。 Tb.Sp.、骨小梁厚度(Tb.Th)、 Tb.N.、 BV C组与B组间差异有显著性。各指标C组与A组间差异均有显著性（P<0.05）。第3组：各指标B组与A组均有显著差异（P<0.05）。除BVF外其余指标C组与B组间差异有显著性（P<0.05）。各指标C组与A组间差异均有显著性（P<0.05）。结论：骨髓基质干细胞与Osx质粒构成的基因活化材料，有明显的骨诱导作用，与不含Osx基质的对照组相比成骨速度更快，新生骨量更多，明显促进了骨组织再生。
