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应用生长分化因子-5治疗大鼠尾椎间盘损伤的实验研究
目的 研究应用生长分化因子-5(GDF-5)局部注射治疗大鼠尾椎间盘损伤的效果.方法 SD大鼠30只,使用20 G皮肤穿刺针对Co7/8、Co8/9、Co9/10椎间盘进行半横贯穿刺,Co7/8 和Co8/9椎间盘穿刺后各注入GDF-5 100 μg(GDF-5组),Co9/10椎间盘穿刺后不进行处理(对照组).术前及术后2、4、8周时对两组椎间盘行X线检查及HE染色观察.结果 术后第2周到第8周,GDF-5组和对照组椎间盘的高度指数呈现持续减小,但GDF-5组椎间盘的高度指数大于对照组(P<0.05).组织学检查发现GDF-5组和对照组椎间盘均有退变,但对照组椎间盘的退变比GDF-5组更严重,组织学评分更高(P<0.05).结论 GDF-5局部注射能促进椎间盘损伤的修复,延缓椎间盘损伤后的退变.
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GDF-5诱导成纤维细胞分化为软骨样细胞
目的 原代分离培养人真皮成纤维细胞(hDFs),应用生长分化因子-5(GDF-5)进行诱导培养,观察细胞的形态,检测软骨细胞相关指标,评价其分化为软骨样细胞的能力.方法 取成人除皱术后的皮肤组织,Ⅰ型胶原酶消化法分离培养hDFs,观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖活性,免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原的表达.用100ng/ml GDF-5的成软骨诱导液培养,观察细胞形态变化,检测Ⅱ型胶原蛋白表达及分泌GAG的能力.结果 hDFs呈长梭形,P10以后仍保持较强的增殖潜能,Ⅰ型胶原表达阳性.诱导后的hDFs逐渐成为圆形、多角形,并聚集生长形成软骨样结节;诱导第21 d的细胞Ⅱ型胶原蛋白表达阳性,GAG被甲苯胺蓝染成蓝色.结论 hDFs经100ng/ml 的GDF-5诱导培养可分化为软骨样细胞.
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转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究
目的：探讨转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的可能性。方法取SD大鼠骨髓间质干细胞，流式细胞仪检测两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29、CD45、CD34、CD24的表达。将增殖至第三代的BMSCs分为对照、TGF-β1、GDF-5、TGF-β1+ GDF-5四组，分别以含不同细胞因子诱导液培养14d后，采用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。结果两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29表达阳性； CD45、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14d后，TGF-β1、GDF-5、TGF-β1与GDF-5三组的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平较对照组均有明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。联合诱导组经过诱导后的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平明显高于TGF-β1组及GDF-5组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 GDF-5与TGF-β1都具有诱导BMSCs向类髓核细胞分化的能力，且二者之间具有协同作用，联合应用可以更好的诱导BMSCs向类髓核细胞分化。
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GDF-5体外转染BMSCs移植修复兔退变椎间盘的实验研究
目的 通过骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外生长分化因子-5(GDF-5)基因转染修饰,然后移植入退变的椎间盘中,观察修复椎间盘退变的效果.方法 脂质体介导的pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒转染兔BMSCs,G418筛选稳定表达株;实验分为转染细胞组、BMSCs组、退变组,2个月后RT-PCR观察椎间盘髓核细胞GDF-5基因表达稳定性,间苯三酚法检测髓核蛋白多糖含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率来观察修复效果.结果 RT-PCR结果 显示BMSCs转染GDF-5基因48h后以及移植手术后2个月时GDF-5基因表达稳定.转染细胞组和BMSCs组髓核蛋白多糖含量明显高于退变组(P＜0.01),转染细胞组高于BMSCs组(P＝0.05).退变组髓核细胞凋亡率比其他两组显著增高(P＜0.01),转染细胞组与BMSCs组之间没有差异(P＝0.09).结论 移植BMSCs或者GDF-5基因转染的BMSCs对退变椎间盘有修复作用,后者的修复效果更好.
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GDF-5基因活化基质体内转染修复兔退变椎间盘的实验研究
目的 通过GDF5基因活化基质体内转染兔退变椎间盘,观察其修复效果.方法 脂质体介导的pcDNA3.1 (+)/GDF-5重组质粒混入Ⅰ型胶原支架,置入兔退变椎间盘;实验分为GAM组,普通支架组,脂质体对照组,2个月后RT-PCR和Westem blot观察椎间盘髓核细胞GDF-5基因和蛋白表达的稳定性,间苯三酚法检测髓核蛋白多糖含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率来观察修复效果.结果 RT-PCR结果显示术后2个月GDF-5基因稳定表达.GAM组蛋白多糖含量高于另外两组(P＜0.05),空白支架组和对照组之间没有差异(P=0.601).GAM组髓核细胞凋亡率明显低于另外两组(P＜0.01),空白支架组和对照组之间没有差异(P =0.902).结论 利用GAM可以有效的进行GDF-5基因体内转染并表达,从而修复退变椎间盘.
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从生长分化因子-5调控关节软骨形成观察加味当归四逆汤防治膝骨关节炎临床研究
目的:通过观察治疗前后膝骨关节炎患者生长分化因子-5 (GDF-5)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及临床症状计分变化,探讨加味当归四逆汤防治膝骨关节炎(KOA)的可能机制及临床效用.方法:采用随机、对照设计,选择符合诊断标准、纳入标准及排除标准的KOA患者62例,按就诊顺序1∶1随机分为两组,每组31例.治疗组予加味当归四逆汤,对照组予仙灵骨葆胶囊,连续4周.详细记录治疗前、治疗后2周及4周临床症状计分变化,应用Real-time PCR技术检测治疗前后GDF-5及VEGF表达变化.结果:治疗组临床治愈10例,显效7例,有效12例,无效2例,总有效率为93.55％;对照组临床治愈6例,显效5例,有效8例,无效12例,总有效率为61.29％,治疗组总有效率明显高于对照组,P＜0.05.治疗前,两组患者临床症状计分对比,无显著性差异.治疗后2、4周,治疗组临床症状计分明显低于对照组,P＜0.05.治疗后,治疗组在治疗后2周关节疼痛明显缓解,晨僵改善,关节功能部分恢复,治疗后4周,关节疼痛显著缓解,晨僵及关节活动消失.治疗前,两组患者GDF-5、VEGF表达对比无显著性差异;治疗后,两组患者GDF-5、VEGF表达上升,且治疗组上升更显著(P＜0.05).结论:加味当归四逆汤可能通过上调GDF-5及VEGF表达,发挥缓解KOA的效用,值得推广应用.
关键词： 膝骨关节炎 生长分化因子-5 血管内皮细胞生长因子 当归四逆汤 -
重组小鼠pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其意义
根据基因库中小鼠生长分化因子-5(GDF-5)序列设计并合成引物,提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,行RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA3.1(+)载体并转化大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,酶切鉴定及测序.结果:DNA琼脂糖凝胶电泳和双酶切均显示出一长约1 603bp的带;测序结果与基因库中的序列完全相同.认为重组小鼠pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒构建成功,为进一步研究其在软骨发育中的作用奠定了基础.
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生长分化因子-5与骨骼发育
生长分化因子属于骨形态发生蛋白信号分子高度保守的亚家族,对骨骼的发育具有至关重要的作用.近年报道表明:生长分化因子-6(growth/differentiation factor-5,GDF-5)的羧端区域与GDF-6和-7高度同源.GDF-5在治疗肌腱或韧带修复,椎间盘退变修复,软骨修复,骨折愈合等方面具有潜在应用价值.
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慢病毒介导C-1-1基因维持“自组装”工程化软骨永久性表型的研究
目的 观察慢病毒介导C-1-1基因对维持“自组装”工程化软骨永久性表型的影响.方法 构建携带C-1-1基因的重组慢病毒表达载体并转染成人骨髓间充质干细胞(hMSCs),用嘌呤霉素筛选获得阳性细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western blot)观察C-1-1基因的表达效果.用含有生长分化因子-5(GDF-5)的成软骨培养基诱导培养3周,3周后重悬细胞,以5×109个/L的细胞终质量浓度接种于2％琼脂糖包被的24孔板,行自组装培养3周后取材.通过Ⅱ型、X型胶原免疫组织化学,甲苯胺蓝染色鉴定分化结果,并与空载体转染组和未转染组比较.结果 测序证实成功构建携带C-1-1基因的重组慢病毒表达载体,转染hMSCs后,C-1-1基因在转录水平和翻译水平都有明显表达.自组装培养3周后,3组标本经甲苯胺蓝染色均可见广泛蓝染并带有异染型着色.C-1-1基因转染组的Ⅱ型胶原平均吸光度(A)值为(0.3754±0.0255),与空载体转染组和未转染组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；X型胶原平均A值为(0.0115±0.0062),显著低于空载体转染组和未转染组(P＜0.01).结论 慢病毒介导C-1-1基因转染后,可增强“自组装”工程化软骨表型的稳定性,抑制其成熟肥大.
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GDF-5对大鼠肌腱细胞及腱鞘滑膜细胞增殖及凋亡的影响
目的 观察生长分化因子-5(GDF-5)对体外培养的大鼠肌腱细胞及腱鞘滑膜细胞增殖的影响,为进一步研究在体内局部添加GDF-5以促进损伤肌腱愈合及改善外源性愈合所致粘连打下基础.方法 MTT法测定不同浓度的GDF-5在体外对肌腱及腱鞘滑膜细胞增殖率的影响;流式细胞仪测定不同浓度的GDF-5在体外对肌腱及腱鞘滑膜细胞凋亡率的影响.结果 GDF-5可以明显促进肌腱细胞的增殖,而对腱鞘滑膜细胞的增殖率的作用较弱.对两种细胞的凋亡无明显影响.结论 添加一定浓度的GDF-5后肌腱细胞增殖率较腱鞘滑膜细胞提高更为明显,而凋亡并未发生改变.
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体外诱导大鼠脂肪源间充质干细胞成肌腱潜能的研究
目的 体外诱导脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AT-MSCs)成肌腱细胞,为临床肌腱损伤的修复提供理论基础.方法 从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出脂肪源间充质于细胞,经生长分化因子-5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导,使其向肌腱细胞分化.应用形态观察和RT-PCR等方法,从形态和分子水平上对诱导分化的细胞进行鉴定.结果 从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出的AT-MSCs呈散在分布,排列不规则,以星形和多角形细胞为主,能稳定增殖传代.经5、10ng/mL GDF-5诱导8d后,大部分细胞呈梭形.RT-PCR结果显示经GDF-5诱导的细胞,I型和Ⅲ型胶原蛋白的表达明显高于未经诱导的对照组;GDF-5诱导的细胞Bcl-2/Bax均高于对照组.结论 从脂肪组织中可以获得具有多向分化能力的AT-MSCs,并能在体外稳定传代.经GDF-5诱导后,AT-MSCs有向肌腱细胞分化的倾向.GDF-5在一定时间内对细胞凋亡有抑制作用,有利于AT-MSCs向肌腱细胞的分化.AT-MSCs有可能替代骨髓间充质干细胞作为组织工程学的种子细胞,用于肌腱损伤的修复.
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不同浓度生长分化因子-5对内侧副韧带成纤维细胞增殖及胶原合成的影响
目的 观察生长分化因子-5(GDF-5)对内侧副韧带(MCL)成纤维细胞增殖能力及胶原合成的影响. 方法 体外培养10周龄SD大鼠MCL成纤维细胞,分别加入不同浓度GDF-5,分为4组:0 ng/mL组、10 ng/mL组、50 ng/mL组、100 ng/mL组,用CCK-8法测定细胞增殖能力,羟脯氨酸测试盒测定细胞总胶原含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测I与Ⅲ型胶原mRNA的表达. 结果 浓度为10、50、100 ng/mL的GDF-5均能增强MCL成纤维细胞的增殖能力,以100 ng/mL的GDF-5作用显著,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).MCL成纤维细胞中加入GDF-5后,羟脯氨酸量增加,I型胶原mRNA表达增加,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05),但Ⅲ型胶原mRNA表达组间比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 GDF-5可以促进MCL成纤维细胞增殖及胶原合成进而促进韧带损伤愈合.
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生长分化因子-5诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨分化过程中对缝隙连接蛋白43表达的影响
目的 探讨生长分化因子-5(GDF-5)在小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨分化过程中对缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响.方法 体外培养小鼠BMSCs,贴壁细胞传代,取第3代细胞,加入地塞米松、VitC、胰岛素和GDF-5诱导培养,72 h后免疫细胞化学和阿尔辛蓝染色分别检测软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达;在诱导24、48和72 h后进行如下检测:MTT法测定GDF-5对小鼠BMSCs增殖的影响;RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学法检测GDF-5对Cx43蛋白表达的影响.结果 MTT结果显示不同时间GDF-5对小鼠BMSCs的增殖无影响;RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学结果表明诱导后不同时间均有Cx43 mRNA和蛋白的表达;诱导72 h免疫细胞化学显示有Ⅱ型胶原蛋白的表达,阿尔辛蓝染色阳性,有蛋白多糖基质的分泌.结论 GDF-5可以通过上调缝隙连接蛋白Cx43的表达来促进小鼠BMSCs向软骨方向的分化.
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应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒
目的：应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人生长分化因子-5（GDF-5）基因重组腺病毒载体，并在 HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法将PCR获取的GDF-5基因插入到质粒pMD19-T中，基因测序鉴定后将目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CM V ，Hind Ⅲ酶切鉴定。重组质粒经 PmeⅠ酶切使之线性化并去磷酸化处理，电转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183，使其在细菌内发生同源重组，卡那霉素筛选，Hind Ⅲ酶切鉴定阳性克隆，扩增重组腺病毒质粒，并转染 HEK293细胞，包装成重组腺病毒Ad-GDF-5，分别采用Western blot、TCID50法对Ad-GDF-5进行蛋白鉴定和滴度测定。结果经PCR扩增得到的GDF-5大小约为1．7 kb ，基因测序结果证实该基因与GENBANK中人GDF-5基因序列相同。pShuttle-CM V-GDF-5、pShuttle-CM V-GDF-5-AdEasy-1经 Hind Ⅲ酶切后均得到大小约为1．7 kb的片段，与GDF-5大小相符。Western blot证实Ad-GDF-5感染HEK293细胞后大量表达成熟GDF-5蛋白。研究结果表明成功地构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体，并制备出5．6×109 PFU/mL的重组腺病毒。结论利用AdEasy-1腺病毒载体系统成功构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体，并制备出高滴度值的重组腺病毒Ad-GDF-5，为进一步研究GDF-5的生物学功能及其相关疾病的基因治疗奠定了基础。
