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Wnt7b重组反转录病毒载体的构建及其在C3H10T1/2中的表达
背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点.前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续.目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-01/2008-08在华盛顿大学医学院和同济大学附属第十人民医院中心实验室完成.材料:pXy-Wnt7b购于ATCC公司,载体pCIG-IRES-EGFP,pLef-Luciferase.pCMV-Rennilla.反转录病毒载体pSFG和包装细胞GP293由华盛顿大学医学院提供.方法:用多步亚克降技术构建目的基因Wnt7b和标记基因加强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescentprotein,EGFP)双表达重组反转录病毒载体pSFG-Wnt7b-IRES-EGFP,在条件培养液中经GP293包装,并任常规培养液中释放出假病毒并将其转染C3H10T1/2细胞,检测成骨活性诱导中的作用和荧光素酶报告基因检测信号转导通路.主要观察指标:①Wnt7b重组反转录病毒转染C3H 10T1/2细胞的表达.②wnt7b诱导C3H 10T1/2碱性磷酸酶生成分析.③Wnt7b信号转导分析.结果:构建日的基因的Wnt7b和标记基因EGFP双表达重组反转录病毒载体能够高效地表达,转染C3H10T1/2细胞后能诱导碱性磷酸晦的生成.Wnt7b信号转导分析可见Wnt7b成骨作用通过Noncanonical途径.结论:Wnt7b在C3H10T1/2中能高效表达,能显著诱导骨发育的重要标志--碱性磷酸酶的生成,Noncanonical途径在其中起重要作用.
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白三烯受体拮抗剂通过Wnt/β-catenin信号通路影响哮喘小鼠气道重塑机制的研究
目的 探讨白三烯受体拮抗剂影响Wnt7b、β-catenin及c-Myc表达,干预哮喘小鼠气道重塑机制的研究.方法采用卵蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠哮喘模型.将小鼠分为对照组、哮喘组以及孟鲁司特钠组.HE染色观察各组小鼠气道炎症情况; ELISA法检测血清OVA-sIgE水平;实时PCR和Western blotting分别定量分析肺组织中Wnt7b、β-catenin及c-Myc mRNA和蛋白表达水平;运用图像采集系统测定支气管管腔周长(PBM)、支气管管壁面积(WAt)、支气管管壁平滑肌面积(WAm)和平滑肌细胞计数(N),上述指标用PBM标准化.结果哮喘组小鼠血清OVA-sIgE表达水平明显升高(P ＜0. 05).Western blotting以及实时PCR结果显示哮喘组Wnt7b、β-catenin及c-Myc蛋白和mRNA较对照组和孟鲁司特钠组表达均显著升高(P＜0. 05).气道重塑指标WAt/PBM、WAm/PBM孟鲁司特钠组均低于哮喘组(P＜0. 05).结论Wnt/β -catenin信号通路可能是哮喘发病机制中的重要因素,白三烯受体拮抗剂(孟鲁司特钠)可能通过影响Wnt7b、β-catenin及c-Myc的表达干预哮喘气道重塑.
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小鼠脊髓发育候选基因Wnt7b的初步研究
目的:探讨Wnt7b基因及Wnt信号系统分子对小鼠脊髓发育的作用.方法:基因测序比较A/J和C57BL/6J两种小鼠Wnt7b基因开放阅读框架序列差异;以RT-PCR方法测定Wnt7b基因在两种小鼠组织中的表达差异;免疫组化法测定Frizzled在2种孕14天胎鼠脊髓上的表达和分布.结果:测序结果中发现两种小鼠Wnt7b开放阅读框架序列结构具有差异;在2种小鼠8种组织中,脊髓、肌肉、脾和肾中的Wnt7b基因表达具有明显差异;免疫组化的测定表明,发育14天的胎鼠脊髓上的Frizzled表达强度和分布范围具有显著差异,尤其是A/J小鼠在神经管周围表达明显强于C57BL/6J.结论:基因表达差异和基因结构差异提示,Wnt7b基因与脊髓发育具有一定的关联,应为一脊髓发育候选基因;Frizzled的强表达与脊髓发育的抑制相关,Wnt7b的信号转导途径介导了控制脊髓发育的过程.
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脑缺血再灌注后大鼠海马Wnt7b的表达
目的 研究成年大鼠脑缺血再灌注后海马齿状回颗粒细胞下层(SGZ) Wnt7b的表达.方法 将44只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组和脑缺血再灌注组,线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型,缺血90 min,术后检测神经功能缺失和脑梗死,在脑缺血再灌注后1、3、7、14 d取大鼠海马组织.RT-PCR技术检测Wnt7b mRNA表达水平；免疫荧光技术检测海马Wnt7b蛋白及β-catenin蛋白表达水平.结果 脑缺血后,大鼠出现严重的脑梗死和神经功能障碍,随再灌注时间延长,大鼠神经功能得到修复.再灌注7d后,健侧脑组织海马Wnt7b mRNA表达上调(P＜0.05),缺血侧脑组织海马Wnt7b mRNA的表达明显上调(P＜0.01).Wnt7b主要分布于SGZ附近,阳性细胞增多(P＜0.01),且该脑区的细胞内β-catenin阳性细胞数目增多(P＜0.01).结论 缺血性脑损伤可刺激Wnt7b在成年海马SGZ的表达上调,Wnt7b可能通过经典Wnt通路参与调节脑缺血后成年海马SGZ的神经发生.
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Wnt7b/β-catenin信号通路分子在肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化过程中的变化
目的 探讨Wnt7b邝联蛋白(β-catenin)信号通路分子在胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(fAEC2)分化过程中的变化.方法 取孕19 d胎鼠肺组织,分离、纯化得到fAEC2.培养细胞48、72、96 h,倒置显微镜观察fAEC2形态变化,免疫荧光染色观察β-联蛋白(β-catenin)的表达,实时定量PCR检测细胞中Wnt7b、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、表面蛋白C(SP-C)和水通道蛋白5(AQP5)的mRNA变化,Western blot法检测cyclin D1、细胞核β-catenin、SP-C、AQP5蛋白的表达.结果 fAEC2培养48 h,β-catenin在细胞膜表达;培养72 h,β-catenin在细胞膜的表达较前减弱,在细胞质、细胞核中表达增强;培养96 h,全细胞β-catenin表达下调.Wnt7b、cyclin D1 mRNA的表达在72 h时显著增高,96 h时下降明显;SP-C mRNA的水平随培养时间的延长逐渐下降,AQP5 mRNA的水平逐渐升高.Cyclin D1、细胞核β-catenin蛋白在72 h时表达上调,96 h时表达下调;SP-C蛋白的表达量逐渐降低;AQP5蛋白的水平逐渐升高.结论 Wnt7b/β-catenin信号通路可能在fAEC2转分化中起重要作用.
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降钙素基因相关肽对氧化应激肺损伤保护作用的Wnt7b/β-catenin信号机制
目的 探讨高氧暴露后早产鼠肺组织Wnt7b和β-连环蛋白(β-catenin)水平变化,高氧、降钙素基因相关肽(CGRP)干预后Wnt通路下游基因转录调控因子T细胞因子(TCF)、靶基因c-myc mRNA的表达,了解Wnt信号转导途径是否参与了氧化应激导致的肺泡Ⅱ型内皮细胞(AECⅡ)损伤死亡和肺发育障碍,以及其与CGRP肺保护作用的关系.方法 westernblot检测95％高氧暴露早产鼠肺组织及高氧、CGRP干预后原代AECⅡWnt7b、β-catenin蛋白水平,RT-PCR测定TCF及c-myc mRNA表达.结果 高氧暴露后3天肺组织Wnt7b及β-catenin蛋白表达即较空气对照组显著增强(P＜0.05),7天时蛋白水平达到峰值,14天时表达有所下降,但仍明显高于空气对照组(P＜0.05).与空气对照组比较,高氧组AECⅡTCF及c-myc mRNA表达明显增强(P＜0.01),高氧+ CGRP组较单纯高氧组TCF、c-myc mRNA表达水平升高更为显著(P＜0.01),空气+ CGRP组TCF、c-myc mRNA表达与空气对照组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高氧暴露后Wnt7b/β-catenin信号通路激活,启动下游增殖相关基因转录,可能是氧化应激性肺损伤时AECⅡ自我修复的机制之一.CGRP可促进Wnt7b/β-catenin活化,Wnt7b/β-catenin信号转导途径可能参与了CGRP的肺保护作用.
