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克隆筛选纯化在大鼠脂肪源性干细胞原代培养中的作用
背景:研究中发现从成体的脂肪组织中可以分离出一种间质干细胞,即脂肪源性干细胞,但传统的分离方法仍存在一些问题需要改进.目的:在脂肪源性干细胞传统的分离方法的基础上进行改进,克隆筛选纯化脂肪源性干细胞.方法:消化离心法分离Lewis大鼠脂肪源性干细胞,有限密度稀释法克隆化及条件培养基筛选,进行原代培养,以克隆筛选的脂肪源性干细胞为实验组,未克隆筛选的脂肪源性干细胞为对照组,观察细胞形态,对比生长曲线、倍增时间,流式细胞仪鉴定脂肪源性干细胞表面标记CD49d、CD29、CD44.结果与结论:经克隆筛选的脂肪源性干细胞与未经克隆筛选的脂肪源性干细胞相比,前者形态均一,生长力旺盛,倍增时间短,多代培养后生长曲线无明显改变,通过流式细胞仪鉴定,实验组与对照组在3~6代之间均表达表面标记CD49d、CD29、CD44.结果证实克隆筛选的纯化方法是脂肪源性干细胞原代培养的有效、经济的纯化方法.
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Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定
目的 用Grp78基因转染人肝细胞癌SMMC-7721,筛选阳性克隆并鉴定.方法 利用真核表达载体pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721,pcDNA3.1+Grp78与转染试剂的比例(μg/μL)分别为2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、2:9,400 μg/mL G418筛选阳性克隆后,传代扩增,Western Blot鉴定克隆的Grp78表达情况.应用pcDNA3.1空载体作为阴性对照.结果 Western Blot显示,转染后的SMMC-7721经G418筛选,除一个克隆不高表达外,其余克隆均高表达Grp78.结论 Crp78转染SMMC-7721的佳转染效率是8:2(转染试剂/DNA),由于假阳性克隆的存在,筛选后的克隆需要鉴定.
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重组人PSP94质粒的快速筛选
目的:建立一种快速筛选阳性重组质粒的方法.方法:直接以菌液为模板,采用两条特异性引物,利用PCR筛选人前列腺分泌蛋白94(PSP94)的阳性重组质粒.结果:利用PCR法成功筛选出了阳性重组质粒.结论:PCR法省时、省力,尤其适用于重组质粒的筛选和鉴定.
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基因差异加危险因子重新诠释免疫识别奥秘
免疫识别奥秘的基本问题在于:(1)为什么免疫系统知道什么物质可以接受(无反应)、什么物质不能接受(排斥)?(2)免疫识别的物质基础是什么:即哪些细胞、蛋白质分子参与识别,哪些对象、底物能够被识别?(3)免疫反应的始动因素是什么?(4)自我耐受是否存在?如果存在,自我耐受是如何建立的?这四大问题历来具有争议性[1],到目前为止尚无一个完整的理论可以圆满地解释众多的观察结果.
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hGH逆转录病毒载体的构建与高滴度克隆筛选的实验研究
尽管基因重组人生长激素(rhGH)已经上市,给生长激素缺乏症(GHD)的患者带来了希望,但rhGH还存在用量大、费用高、副作用较多等问题,更重要的是其并未涉及GHD的遗传学病因.随着分子生物学的迅速发展,给人们运用重组DNA技术进行GHD 基因治疗带来了希望.自2001年起,我们进行了人生长激素(hGH)逆转录病毒表达载体构建的实验研究,并建立了能产生高滴度缺陷性逆转录病毒的产毒细胞.这为下一步感染靶细胞,进行GHD基因治疗研究奠定了基础.
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pcDNA3.0/hTH和 pcDNA3.1/hGDNF共转染SH-SY5Y细胞的克隆筛选和鉴定
我们采用多基因表达技术把携带人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) 和酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组质粒转入SH-SY5Y细胞中,构建同时分泌人TH和GDNF的工程细胞,为探讨双基因治疗帕金森病(PD)提供依据,现将结果报道如下。 一、材料与方法
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抑制性消减杂交技术及其应用研究进展
抑制性消减杂交是结合抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法,具有特异性高、假阳性率低、操作简便、灵敏度高等特点.在正常和异常状态下基因的表达变化、差异基因的克隆和鉴定对新基因的认识和基因表达调控有着重要意义.SSH在心血管疾病、肿瘤等方面的研究中取得了重要进展.
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差异表达基因的克隆筛选及其在肿瘤研究中的应用
高等动物的细胞中大约有100?000个不同的基因,不同类型的细胞所表达的基因不同,而且即便是同一类型的细胞,在特定时刻同时表达的基因也仅为很少的一部分,约占基因总数的10%~15%。不同生理和病理状态下基因的选择性表达决定了所有的生命过程。比较细胞基因表达的差异可以获得与生命过程相关的信息,并且有助于揭示疾病的发生发展机理。差异表达基因的克隆技术正随着分子生物学技术的发展而不断改进,也越来越多地应用于肿瘤学的研究。1 差异表达基因克隆技术的研究进展 目前差异表达基因克隆的技术较多,和肿瘤研究关系比较密切的主要包括差示PCR技术、消减杂交技术以及近几年发展起来的基因芯片技术。