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抗人CD25嵌合抗体基因的构建及其瞬时表达研究
目的:构建抗人CD25嵌合抗体基因并在哺乳动物细胞中进行瞬时表达和初步鉴定.方法:采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并利用基因拼接法构建嵌合抗体基因.用脂质体法瞬时转染三种哺乳动物细胞,并使用ELISA、FCM、WB、Dot blot和免疫荧光法进行检测.结果:成功克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并构建了抗人CD25嵌合抗体表达质粒.瞬时转染结果表明所表达的嵌合抗体保留了亲本抗体WuTac的抗原结合力.结论:成功构建了抗人CD25嵌合抗体基因,为其进一步研究打下基础.
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人白细胞介素12两个亚基基因p35、p40拼接的新方法
目的:探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法.为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础.方法:采用两个牛弹性蛋白基序(10个氨基酸)的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因.根据人IL-12 p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ酶切位点.通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12 p35与p40基因片段.利用Kpn Ⅰ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4 DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增.利用Kpn Ⅰ内切酶对连接产物进行酶切鉴定.将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序.结果:通过PCR分别获得约1 000 bp大小的p40基因片段与600 bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1 600 bp左右的拼接产物,采用Kpn Ⅰ内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1 000和600 bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致.拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1 600 bp大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致.结论:利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接.建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的C生物学功能以及基因治疗提供实验基础.
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采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库
目的构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库.方法从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度(1:1024)的人全血中分离外周血单个核细胞(PBMC),经RT-PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区,再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区(Cκ)和重链恒定区(CH1),将轻链可变区和轻链恒定区(Cκ)及重链可变区和重链恒定区(CH1)进行第1次基因拼接,分别形成κ轻链和Fd重链,再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第2次基因拼接,形成完整的Fab基因,与pComb3H-SS噬菌体质粒连接后,电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue.结果通过多次电穿孔转化,获得总容量为4×105库容的噬菌体抗体库.结论构建的Fab抗体库可用于筛选特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子.
关键词： 基因拼接 Fab噬菌体抗体库 乙型肝炎病毒表面抗原 -
人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建
目的:应用体外基因拼接及TA克隆技术构建含PRKAG2基因的载体.方法:通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒(GenBank登记号BC 068598),其在N端缺失了44个氨基酸,根据已知的PRKAG2基因序列(GenBank登记号NM_016203),设计搭桥引物及序列扩增引物,通过PCR搭桥方法,合成完整全序列的PRKAG2基因,并将其克隆到TA载体,将得到的阳性克隆测序鉴定.结果:拼接出全长1759bp的PRKAG2基因,目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致.结论:成功的构建了全长人PRKAG2基因的TA克隆,为进一步研究PRKAG2基因的功能提供了模板.
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CD44基因拼接体在大肠癌中的表达及其临床意义
近年来,人们认为CD44作为细胞表面黏附分子与整合跨膜糖蛋白,在肿瘤发生、发展及转移中起着十分重要的作用,尤其是CD44基因拼接体--CD44v6更为引人注目[1].本文应用免疫组化方法,探讨CD44v6在大肠癌组织中的表达及其与淋巴转移程度的关系.
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TRADD基因外显子的拼接及重组腺病毒的构建
目的 构建含有人TRADD基因片段的重组腺病毒载体.方法 从人肝组织中提取总RNA,逆转录得到cDNA.按照TRADD基因4个外显子的基因序列设计引物,分别扩增得到4个外显子的基因片段.对4个外显子进行基因拼接,得到全长的TRADD片段.利用AdEasy系统构建TRADD重组腺病毒,测定病毒滴度.并转染成纤维细胞.结果 拼接成功939 kb的TRADD基因,行PCR扩增重组腺病毒中TRADD基因,在略小于1000kb处见到明显的TRADD条带.结论 构建成功的含有TRADD基因片段的重组腺病毒.可用于转染人成纤维细胞.用于检测TRADD对病理性瘢痕成纤维细胞的影响.
关键词： 肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白 克隆 基因拼接 腺病毒 -
膜联蛋白32与低分子质量单链尿激酶融合基因的构建及高效表达
目的:构建膜联蛋白32(annexin32,Anx32)和低相对分子质量单链尿激酶(ScuPA32k)的融合基因,并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用重叠区扩增法进行基因拼接,然后在谷胱甘肽S转移酶原核表达系统内表达,Western 印迹验证表达产物.结果:重叠区扩增得到1.8 kb融合基因,该基因在原核表达系统内得到高效表达,表达量占菌体总蛋白的26%,Western 印迹证明表达产物正确.结论:用重叠区扩增法进行基因拼接快速、简便.
关键词： 膜联蛋白32 低相对分子质量单链尿激酶 基因拼接 -
乳链菌表达系统的构建及其鉴定
目的构建可以在乳链菌表达外源性基因的系统.方法采用基因拼接方法拼装含有P59启动子、USP45蛋白信号肽及多克隆位点的基因序列,并将其连入质粒pBluescript Ⅱ SK(+)以形成重组质粒pBS-PU,PCR扩增USP45终止子并连接至质粒pBS-PU构建可将外源性基因分泌表达于菌体外的质粒pNBC1000,PCR扩增M6基因随后连接至pNBC1000构建可将外源性基因分泌表达于菌体外及锚定表达于细胞壁的质粒pNBC2000.通过将增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因连接至质粒pNBC2000,激光共聚焦显微镜下观察含有pNBC2000-EGFP质粒及对照质粒的细菌,验证EGFP定位表达情况.结果所构建的表达系统可以表达EGFP基因.结论通过基因拼接方法成功构建了乳链菌表达系统,其可将外源性基因分泌表达于菌体外.
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四株分离自新生儿的ESBLs菌表型与基因型检测
目的:研究ESBLs表型与基因型的关系.方法:(1)药敏试验:K-B法,(2)ISBLs表型确认:双纸片协同法,(3)基因型检测:分别以TEM、SHV通用引物设计PCR体系,行PCR扩增,产物进行分段测序,由测序软件作全基因拼接.结果:1、3、4号菌株为Epn,2号菌株为Eco,其中2、3号株来自同一患儿的不同部位.4株均为TEM亚型,2、3、4号株之序列与国内已报道的TEM序列完全一致,1号株测得序列与2、3、4号株TEM序列有一个碱基因的差别.讨论:苏州地区至少存在两种TEM基因型.4株菌表型耐药状况严重,临床治疗效果不乐观.2、3号株来源于同一患儿不同部位,虽不同菌种,但耐药质粒为同一基因亚型,不排除不同种菌株之间的质粒传播的可能性.PCR及其产物的测序为ESBLs的研究提供了一种有效手段.
