首页 > 文献资料
-
乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3基因的克隆及原核表达
目的 克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础.方法 提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达.表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确.表达的重组蛋白相对分子质量约为27 000和20 000,主要以包涵体的形式表达.重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别.结论 已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达.
关键词： 乙型脑炎病毒 SA14-14-2株 NS3基因 克隆 原核表达 -
乙型脑炎病毒SA14-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性
目的 研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据.方法 将JEV SA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较.结果 各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势.8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用.E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2 142或2 143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变.4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化.PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3'端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上.结论 JEV SA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全.
关键词： 乙型脑炎 减毒活疫苗 SA14-14-2株 基因稳定性 生物学稳定性 -
乙型脑炎减毒活疫苗病毒SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种后的生物学和分子生物学特性
目的 研究乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后的生物学和分子生物学特性,进一步评价该株病毒的稳定性和安全性.方法 将乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA4-14-2株胸腔接种的三带喙库蚊研磨,离心收集上清液,接种于BHK21细胞中培养,得到SA14-14-2 MIC1病毒液.应用空斑形成单位法测定病毒滴度,再进行小鼠脑内毒力测定和乳鼠脑内回传后毒力返祖试验.提取病毒RNA,RT-PCR扩增E基因片段,测序后与SA14-14-2原株的E基因序列进行比较分析.结果 SA14-14-2 M1C1病毒液滴度达1.4×107 PFU/ml,小鼠脑内毒力测定结果无小鼠发病死亡,乳鼠脑内传代对小鼠的脑内致病力很低,毒力为1.9 LgLD50/0.03ml,小于《中国药典》规定的3.0 LgLD50,且皮下注射未见小鼠发病死亡.扩增出的E基因片段序列与原株相比较,只有E区1 340位一个核苷酸的变化A→G,导致E447位1个氨基酸的改变D(Asp)→G(Gly),此差异位点不是SA14-14-2株发生基因变异的8个位点之一.结论 SA14-14-2疫苗株病毒经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后,其生物学(弱毒)特性和基因特征(E区8个氨基酸突变)未发生改变,进一步证实了该病毒的稳定性.
关键词： 流行性乙型脑炎 SA14-14-2株 三带喙库蚊 生物学特性 分子生物学特性 -
乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性
目的 对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性.方法 根据DNA序列数据库(GenBank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体, 转化至大肠埃希菌DH5α中, 挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性.结果 乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸.3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3′端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入.与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%.SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL.结论 乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据.
关键词： 乙型脑炎减毒活疫苗 SA14-14-2株 全基因组序列 E蛋白 遗传稳定性
