肿瘤来源的外体在肿瘤发生发展中的作用

外体(exosome)是多种细胞在正常生理过程中分泌的含有多种细胞膜分子及相关蛋白的小囊泡,其异常分泌是恶性肿瘤的重要标志,并与肿瘤细胞生长、免疫抑制、肿瘤血管生成及化疗耐药密切相关.肿瘤细胞分泌大量的exosome参与癌蛋白和免疫抑制分子的转移,促进肿瘤的生长和转移.肿瘤来源的外体(TEX)可存在于肿瘤患者血浆、恶性渗出液和肿瘤细胞培养上清液中.TEX含有肿瘤的相关抗原,并将其递呈给T细胞以活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL),发挥抗肿瘤作用.Exosome具有安全、有效、稳定等生物学特征可为恶性肿瘤的诊治提供新的策略.

外体负载特异性抗原促进小鼠抗肿瘤效应的研究

目的:验证人树突状细胞(DC)分泌的外体(exosomes,EXO)负载NY-ESO-1抗原促进转基因小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)扩增及增强肿瘤杀伤效应.方法:应用人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen,HLA)-A2阳性健康成人的外周血分离诱导外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)来源的成熟DC,利用一系列不同速度的离心结合膜超滤的方法,从其上清中提取成熟DC分泌的EXO.人工负载肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1于EXO之上(EXO/Ag),与聚肌胞(PolyI-C)共同免疫健康HLA-A2转基因C57小鼠,并在体系中加入EXO/Ag继续体外培养脾细胞.使用以上方法获得的脾细胞行四聚体实验,并对K562细胞及黑色素瘤细胞(对照组)行杀伤实验.结果:脾细胞中NY-ESO-1特异的CTL有所扩增,对K562肿瘤细胞有一定杀伤效应.体外实验显示NY-ESO-1特异的CTL较前大量扩增,对K562肿瘤细胞杀伤效应大大增加.结论:EXO/Ag结合PolyI-C作为新一代抗肿瘤疫苗具有良好的应用前景.

脐带MSC来源外体上调Smad7表达修复大鼠急性心肌损伤

目的 探讨人脐带间充质干细胞来源的外体(huc-exosomes)对SD大鼠急性心肌梗死(AMI)的修复作用及其可能的分子机制.方法 体内构建SD大鼠AMI模型,分为假手术组、AMI+ PBS组和AMI+ exosomes组,小动物高频彩色超声仪检查心功能;72 h后处死取心肌组织,western blot检测组织内Smad7蛋白变化;体外培养心肌细胞系H9C2及原代培养心肌组织细胞,免疫荧光法鉴定原代培养心肌组织细胞,分为正常氧+ PBS、正常氧+exosomes、缺氧+PBS、缺氧+exosomes 4组,分别提取各组的蛋白质或RNA,用定量PCR、western blot分别检测Smad7 mRNA和蛋白质变化.结果 成功构建了SD大鼠AMI模型,超声心动图结果显示,尾静脉注射huc-exosomes可改善AMI大鼠的心功能.定量PCR及western blot结果显示,exosomes处理使心肌细胞中Smad7 mRNA和蛋白质的表达水平均上调.结论 huc-exosomes对AMI有修复作用,exosomes可能通过调节Smad7的表达促进细胞修复,Smad7可作为huc-exosomes介导损伤修复的判断指标.

人脐带间充质干细胞来源的exosomes对脂多糖诱导的肝星状细胞活化的抑制研究

目的 探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)来源的外体(exosomes,hucMSC-Ex)对脂多糖(LPS)诱导的人肝星状细胞系LX2活化的抑制作用及其可能机制.方法 体外培养LX2细胞,分别设PBS对照组、LPS组(100 ng/mL)及hucMSC-Ex组(LPS+ 150 μg/mL hucMSC-Ex),48 h后收集细胞并提取相应的RNA及蛋白质.western blot检测LX2活化相关指标(α-SMA、ColⅠα1及TGF-β1蛋白)和凋亡指标(Bcl2、Bax及caspase3蛋白)的表达情况;RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测α-SMA mRNA表达水平;MTT法分析hucMSC-Ex对LX2细胞活化后增殖的影响.结果 LPS可刺激LX2细胞活化,活化后的LX2细胞形态由不规则形状向成纤维细胞样改变,并高表达α-SMA、ColⅠα1及TGF-β1蛋白,其灰度值分别上升约2.45、2.34、2.77倍(P均＜0.05);Bax及caspase3蛋白表达下降而Bcl2蛋白表达增强;LX2增殖能力增强;经hucMSC-Ex处理后,细胞形态由细长向不规则形态转变,α-SMA、CollⅠα1及TGF-β1蛋白表达减弱,高表达Bax及caspase3蛋白而Bcl2蛋白表达下降,且细胞增殖减少(F=23.44,P＜0.05).结论 hucMSC-Ex能够抑制LPS诱导的LX2细胞活化,降低其增殖能力并促进细胞凋亡.

人脐带间质干细胞来源的exosomes对肝细胞过氧化损伤的保护作用

目的 探讨人脐带间质干细胞来源的exosomes (hucMSC-Ex)对四氯化碳(CCL4)诱导的肝细胞氧化应激损伤的保护作用.方法 将体外培养的人肝细胞系HL7702分为对照组(常规培养)、CCL4损伤组及hucMSC-Ex处理组(CCL4+ hucMSC-Ex).免疫荧光检测CM-Dil染料标记的hucMSC-Ex进入HL7702细胞的情况；免疫组织化学法分析细胞过氧化物8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)的表达水平；比色法检测培养上清中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量；western blot分析P38MAPK通路的活化情况.结果 免疫荧光结果显示,hucMSC-Ex可转移进入HL7702细胞；比色法结果表明,与对照组相比,CCL4损伤组HL7702细胞培养上清中GSH含量下降,MDA上升(P＜0.01),hucMSC-Ex处理组GSH和MDA含量无显著性变化；免疫组化结果显示,与对照组相比,CCL4损伤组8-OHdG表达阳性的HL7702细胞(胞核棕黄色)数量明显增高,而hucMSC-Ex处理组阳性细胞数量无明显变化；western blot结果表明,CCL4损伤组P-P38蛋白表达水平明显上升,而hucMSC-Ex处理组P-P38蛋白表达下降,其P-P38与P38/GAPDH蛋白的灰度值较CCL4损伤组下降约2.4倍.结论 HucMSC-Ex可减轻CCL4诱导的肝细胞过氧化损伤.

胃癌外体(exosome)内miRNA-1的检测分析

目的 检测胃癌细胞系来源外体(exosome)及其胃癌组织和血清中exosome内miRNA-1的表达水平并分析其临床意义.方法 采用实时荧光定量RT-PCR分别检测胃癌细胞系来源exosome、胃癌患者组织及血清exosome内miRNA-1的表达水平,分析其与临床资料相关性,并绘制ROC曲线进行效能分析.结果 miRNA-1在人胃癌细胞系MGC-803(6.51±0.41)和SGC-7901(14.81±1.30)中的含量明显高于胃上皮细胞系GES-1 (1.05±0.25),差异有统计学意义(t分别为11.26、10.38,P均＜0.01);而MGC-803、SGC-7901细胞培养上清exosome内miRNA-1的表达水平(49.98±11.77和28.68±4.66)显著高于GES-1来源exosome(1.00±0.02)差异有统计学意义(t分别为4.162、5.942,P均＜0.01);25对胃癌组织标本中有18例癌组织miRNA-1表达上调,7例表达下调,胃癌组织[1.110(0.070,4.307)]平均表达水平高于癌旁组织[1.149(1.110,2.075)],差异有统计学意义(Z=-1.897,P＜0.05).miRNA-1在胃癌患者血清exosome内的表达水平[4.130(0.151,12.720)]较体检健康者血清exosome内表达水平[0.704(0.077,7.243)]明显增高(Z=-2.407,P＜0.05),且与胃癌的淋巴结转移相关;胃癌患者血清exosome内miRNA-1的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.723 0,95％可信区间(CI)为0.627 0 ～0.818 7,cut off值为2.39,敏感性为66％,特异性为68％.结论 胃癌组织及其胃癌患者血清来源exosome内富含miRNA-1,有望成为新的胃癌诊断标志物.

血清外体内fibulin-1检测在胃癌诊断中的应用

目的 评价血清外体(exosome)内fibtlin-1蛋白分子在胃癌诊断中的临床应用价值.方法 Exosome沉淀法提取胃癌细胞及胃上皮细胞上清、胃癌患者及体检健康人血清exosome;western blot、ELISA法检测exosome内fibulin-1蛋白的表达水平,绘制ROC曲线并进行诊断效能分析.结果 胃癌细胞及其上清exosome内fibulin-1表达水平显著低于胃上皮细胞及其上清exosome;胃癌患者血清exosome内fibulin-1的表达水平(31.94±16.92) μg/mL明显低于体检健康者(47.16±17.27) μg/mL(P=0.045);胃癌患者血清exosome内fibulin-1的ROC曲线下面积(AUCRoc)是0.727 5,95％可信区间(CI)为0.569 4 ～0.885 6,cut off值为43.19 μg/mL,敏感性为70％,特异性为75％.结论 血清exosome内fibulin-1分子有望作为胃癌诊断的潜在新型分子标志物.

胃癌患者胃液中外体的分离和鉴定

目的 探讨胃癌患者胃液中是否存在外体(exosomes).方法 用离心超滤和蔗糖密度梯度超速离心法从患者胃液中分离并纯化exosomes.透射电镜检测其大小和形态,并用Nanosight纳米微粒分析系统进行验证;western blot检测exosomes标志性蛋白CD9、CD63的表达.结果 透射电镜下观察分离的胃液exosomes呈椭圆形或碟状的囊泡结构,直径在40～ 100 nm,Nanosight纳米微粒分析系统证实其纯度为92.9％;western blot结果表明,胃液来源exosomes表达标志性蛋白CD9、CD63.结论 胃癌患者的胃液中存在exosomes.

人间充质干细胞来源外体诱导胃癌细胞恶性转化

目的 探讨人间充质干细胞(MSCs)能否通过外体(exosome)促进胃癌细胞迁移、侵袭和化疗抵抗,诱导胃癌的恶性转化.方法 提取不同细胞来源的exosome(HFL-ex和MSC-ex),并用可视型纳米颗粒分析仪及westem blot进行鉴定;Transwell实验检测不同处理因素下对照组、HFL-ex组和MSC-ex组细胞的迁移、侵袭能力;构建免疫缺陷小鼠模型,处理7d后分别检测对照组、5-FU组、HFL-ex组和MSC-ex组小鼠的肿瘤体积.结果 可视型纳米颗粒分析仪结果表明,HFL-ex和MSC-ex的直径约为(110±49)nm,westem blot证实其表面均表达CD63蛋白;Transwell实验结果表明,与HFL-ex比较,MSC-ex可促进SGC-7901细胞的迁移与侵袭(P均＜0.05);荷瘤实验结果显示,MSC-ex组小鼠肿瘤体积大于5-FU组和HFL-ex组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MSCs可通过旁分泌exosome的方式促进胃癌细胞迁移、侵袭和化疗抵抗,诱导胃癌的恶性转化.

3种分离尿外体方法比较

目的 对超速离心法、超滤法和沉淀法3种分离尿液中外体(exosome)方法进行比较,为临床研究选择合适的分离方法提供依据.方法 用超速离心法、超滤法和沉淀法3种方法分别从4例健康人和2例慢性肾脏病(CKD)患者尿液中分离exosome.用透射电镜观察尿exosome形态结构,BCA法检测exosome总蛋白质浓度,分别在尿体积及exosome总蛋白质浓度相同上样条件下,用western blot(WB)检测exosome标志蛋白TSG101和Alix.结果 3种分离方法均能获得直径为40 ～ 100 nm的圆形膜性囊泡;WB能检测到超速离心法及超滤法分离得到的exosome标志蛋白,而沉淀法未检测到;超滤法尿exosome总蛋白质浓度远高于超速离心法及沉淀法;超速离心法尿体积及exosome总蛋白质浓度相同情况下上样时所有样本均能检测到exosome标志蛋白,且表达量在3种方法中均多;超滤法尿体积相同情况下上样,4例健康人均能检测到exosome标志蛋白,而以exosome总蛋白质浓度相同上样时,仅有2例健康人能检测到标志蛋白,但2例CKD患者在此两种上样方式未检测到标志蛋白;沉淀法两种上样条件下所有样本均未检测到exosome标志蛋白.结论 超速离心法分离尿exosome效果较好,开展尿exosome临床研究时建议选择超速离心法.

人脐带间充质干细胞来源外体提取方法的比较

目的 比较蔗糖密度梯度离心法和差速离心法提取的脐带间充质干细胞来源外体(hucMSC-Ex)在高丰度蛋白质含量和纯度上的差异.方法 分别用蔗糖密度梯度离心法和差速离心法提取hucMSC-Ex,透射电镜下观察两法提取的外体的形态结构,SDS-PAGE分析二者的蛋白质组分,western blot检测二者的表面标志蛋白CD9和CD81,免疫荧光法检测二者内化至靶细胞EA.hy926的数量.结果 两种方法提取的hucMSC-Ex均为直径约30～100 nm的圆形或椭圆形膜性囊泡结构;在相同蛋白质总量下,差速离心法提取的hucMSC-Ex高丰度蛋白质含量明显低于蔗糖密度梯度离心法,但其表面标志蛋白CD9和CD81的表达量却明显高于蔗糖密度梯度离心法;在相同蛋白质浓度下,差速离心法提取的hucMSC-Ex被靶细胞EA.hy926细胞内化的数量更多.结论 两种方法均能成功提取hucMSC-Ex,差速离心法提取的hucMSC-Ex纯度更高,而高丰度蛋白质含量明显降低.

外体(exosomes)对肿瘤微环境作用的研究进展

外体(exosomes)是体内来源的且能被多种类型的细胞释放到微环境的小囊泡,携带来自宿主的微小RNA(microRNA,miRNA)、mRNAs、DNA片段及蛋白质等成分.不同肿瘤微环境细胞(如免疫细胞、间充质干细胞和肿瘤自身细胞等)分泌的外体能介导肿瘤细胞与肿瘤微环境细胞间物质和信息的传递.研究表明,肿瘤细胞分泌的外体可募集和重建肿瘤微环境的相关成分,促进肿瘤的血管生成、肿瘤转移及执行免疫抑制功能.本文就目前外体对肿瘤微环境的研究进展作一综述.

胃癌患者血清中exosome的水平及临床意义

目的 探讨胃癌患者血清中外体(exosome)的水平及其临床意义.方法 用ELISA法检测77例胃癌患者、34例体检健康者血清中EXOSC2(exosome component 2)的含量,以评估血清中exosome的水平,并分析其与胃癌患者临床病理特征的关系.结果 胃癌患者血清中EXOSC2含量为[670.92(572.49,1 287.59)] pg/mL,健康对照组为[585.49(493.63,862.10)]pg/mL,两组间差异有统计学意义(P＜0.05).胃癌患者中,淋巴结转移组血清中exosome水平明显高于无淋巴结转移组(P＜0.01);Ⅲ、Ⅳ期exosome水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05);低分化组水平明显高于高分化组(P＜0.05).胃癌患者不同年龄、性别、肿瘤浸润深度、有无远处转移和肿瘤大小间exosome水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胃癌患者血清中exosome水平的升高与肿瘤淋巴结转移、TNM分期及分化程度有关,测定血清中exosome的水平有助于判断胃癌的进展.

外体及其在肿瘤生物治疗中的应用

外体是活细胞释放到胞外的囊泡,含脂质双层膜,是细胞与外界信息传递的载体.肿瘤细胞来源的外体含肿瘤相关抗原,经树突状细胞呈递,可激发肿瘤特异性细胞毒作用和交叉抗肿瘤作用.树突状细胞释放的外体表面有大量的抗原呈递分子,而且性质稳定,易保存,可快速批量生产.因此,外体作为非细胞瘤苗在恶性肿瘤生物治疗方面意义重大.

肿瘤研究的新焦点——外体

可溶型细胞因子受体产生机制的研究进展

细胞因子结合表达于细胞膜上的细胞因子受体发挥其生物学功能.在体液中往往可检测到可溶型细胞因子受体.可溶型细胞因子受体与配体结合,可能促进或拮抗其膜型受体所介导的功能,从而参与多种生理功能调节,以及炎症反应、自身免疫病和肿瘤等疾病.可溶型细胞因子受体产生机制主要包括膜型受体胞膜外区蛋白水解酶酶切后的脱落,mRNA水平的差异剪接,囊泡样外体分泌以及糖基磷脂酰基醇锚定分子的剪切等.