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RAPD技术在微生物学领域的研究与应用
新型DNA指纹技术--RAPD(随机多态DNA)作为一种基因分析法,具有简便、重复性好、价格相对低廉等诸多优点,在无需预知靶基因DNA的情况下,可迅速得出多态性很好的DNA指纹图.目前,这种方法在细菌、分枝杆菌、真菌等领域中都已得到了广泛的应用.
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EBV-LMP1通过NFκB介导的信号传导途径活化CyclinD1机制初探
目的:探讨EBV-LMP1促进细胞增殖,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制和EBV-LMP1通过NFκB介导的信号传导途径活化细胞周期重要正性调节因子CyclinD1表达的机制.方法:利用已建株的,LMP1表达受四环素衍生物强力霉素严密调控的pTet-on-LMP1-HNE2稳定鼻咽癌细胞系,用强力霉素诱导LMP1的表达,Western blotting从蛋白质水平分析LMP1诱导CyclinD1表达的表达动力学,包括时间效应及剂量效应,进一步在LMP1稳定表达的鼻咽癌细胞系CNE-LMP1中,用反义硫代磷酸化寡聚核苷酸分别从LMP1,NFκBp65及CyclinD1三个层次阻断,结合报导基因分析法分析从转录水平阻断后,CyclinD1报导基因强度的差异,结合流式细胞仪分析这三个层次的阻断对细胞周期产生的影响,从而探讨在鼻咽癌中,EVB-LMP1促进CyclinD1表达的机制.结果:在pTet-on-LMP1-HNE2细胞中,Western blotting方法显示,较未经诱导比较,随着LMP1的诱导表达,CyclinD1的表达明显增强,且表达具有时间依赖性,但是剂量诱导表达效果不显著.在CNE-LMP1细胞系中,导入LMP1、p65及CyclinD1的反义寡聚核苷酸从三个层次分别阻断各自的表达后,报导基因分析结果显示,CyclinD1的报告基因活性均被抑制,分别下降7.1倍,13.7倍,及35.7倍,流式细胞仪分析结果显示,较之未处理的CNE-LMP1细胞,反义LMP1、P65及CyclinD1均可抑制细胞进入增殖期,分别抑制了35%,26%及7%.结论:EBV-LMP1可能经NF-κΒ介导的信号传导途径活化CyclinD1表达,导致细胞周期紊乱,进而赋于鼻咽癌细胞恶性增殖特性.通过本研究将信号传导与细胞周期这两个当前活跃的研究领域交叉起来,为阐明EB病毒致瘤机制开辟了一个新的视野.
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G-6-PD缺陷的实验室研究进展
红细胞(RBC)G-6-PD缺乏是临床上常见的遗传性缺陷病之一。此酶缺乏常引起一些溶血性疾病，如蚕豆病、新生儿黄疸、药物性溶血等。据估计，在全球已有约4亿人受累，且呈逐年上升趋势［1］。我国呈“南多北少”分布，在云南、广东、广西发生率较高［2］。目前，实验室有关G-6-PD缺乏的检测方法主要有定性试验，定量测定以及基因分析法。随着医学基础科学和技术的发展与进步，人们对传统的检测方法加以改良和创新，摈弃了较早期的费时、费工，特异性差的方法，使其检测手段更趋于简单，精密和向自动化方向发展。为此，笔者对G-6-PD缺乏的实验室研究进展综述如下：1 G-6-PD缺陷的初筛试验1.1 高铁血红蛋白还原试验 利用亚硝酸盐能使Hb氧化为高铁Hb(MHb)，还原性辅酶Ⅱ(NADP)在G-6-PD和美蓝的参与下，使高铁Hb还原成亚铁血红蛋白。当RBC内缺乏G-6-PD时，高铁Hb还原的速度显著减慢，高铁Hb在630～650mm处有一吸收峰。该法无需特殊试剂，简便易行。灵敏度高，特异性低，假阳性高。在不稳定Hb病，高脂血症，巨球蛋白血症等均可呈阳性。1.2 荧光斑点试验 此法为WHO推荐方法，利用NADPH在紫外线波长340nm照射下发生荧光，而NADP不显荧光的原理，只需10～20μl血与溶血剂(含G6P、NADP等试剂)及缓冲液孵育短时间后，滴于滤纸待干，在340nm下观察。正常人显荧光，G-6-PD缺乏者不显荧光或显微弱荧光。对半合子和纯合子检出率高，但对杂合子敏感性差，检出率仍不高。1995年谢彦晖等［3］认为把该法的佳工作点控制在0.45mmol/L，G6P，0.34mmol/L NADP，37℃下反应3min，可使特异性、敏感性和准确度都达到90%以上。
关键词： 葡萄糖磷酸脱氢酶缺乏 红细胞 基因分析法 贫血 溶血性
