反义寡聚核苷酸抗柯萨奇病毒感染的研究

目的 针对柯萨奇病毒-3型(CVB3)基因组重要功能区设计系列反义寡聚核苷酸序列,通过实验观察特异性反义核酸对病毒感染细胞的抑制作用.方法 通过病毒空斑形成试验及致细胞病变作用,了解反义核酸抑制及阻断CVB3病毒感染细胞的能力.结果 实验所设计的反义核酸中SCB1对感染HeLa细胞的CVB3病毒活性抑制作用较强,当病毒感染量为1 MOI时,病毒活性抑制率高达90%;SCB4和SCB2均为75%;SCB6有50%抑制作用;而SCB3和SCB5以及非特异性对照序列对CVB3病毒基因基本没有任何作用.结论 通过以上实验确定SCB1、SCB2、SCB4等较好的抗病毒反义核酸序列,为进一步研究反义核酸抗病毒作用提供了重要的实验基础.

NR2B反义寡核苷酸对大鼠海马CA1区NR2B mRNA表达的影响

目的:观察NMDA受体2B亚单位(NR2B)反义寡核苷酸(ANR2B)对海马CA1区NR2B mRNA表达的影响,筛选有效的ANR2B,探讨改变NR2B mRNA表达的新方法.方法:正常SD大鼠,海马CA1区立体定位注射ANR2B,灌注取脑,连续冰冻切片,原位杂交组织化学方法染色,光镜下观察NR2B mRNA在ANB2B作用下的表达变化.结果:正常大鼠海马CA1区立体定位注射ANR2B后,注射点及其周围NR2B mRNA原位杂交染色强度明显下降,仅有少量锥体细胞和颗粒细胞散在分布;而在注射NR2B正义寡核苷酸(SNR2B)、生理盐水(NS)及NS插针不注射(NSNO)的海马切片上,海马CA1区的染色特征与注射ANR2B有明显差别,其作用区锥体细胞、颗粒细胞及顶树突的NR2B原位杂交染色强度无明显变化.结论:ANR2B能够降低NR2B mRNA在正常大鼠海马CA1区的基础性高表达.

反义寡聚核苷酸抗柯萨奇A24病毒感染的研究

目的 针对柯萨奇病毒A组24型(coxsackievirus A24,CVA24)基因组特殊功能区设计系列反义寡聚核苷酸序列,通过实验观察特异性反义核酸对病毒感染细胞的抑制作用.同时进行抗病毒作用的量效评价.方法 通过抑制空斑形成实验、病毒致细胞病变作用及免疫印迹等实验,了解反义核酸抑制及阻断CVA24病毒感染细胞的能力,及经反义核酸抑制后病毒结构蛋白在感染细胞中的表达状况,并对抗病毒效果较好的反义核酸进行量效关系测定.结果 从本实验所设计的8条反义核酸中,筛选出5条能较好抑制CVA24的反义核酸序列,分别为SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568.当病毒感染量为1 M0I时,5 μmol/L的上述反义核酸的病毒活性抑制率均在50%以上.经过量效关系分析显示,0.3 μmol/L的SCA568已经对细胞产生较强的保护作用,对病毒空斑形成抑制程度达80%;在2.5 μmol/L的SCA568保护下,病毒空斑抑制率达到90%以上,足几条反义核酸中抗病毒效果好的一条.SCA568对病毒早期结构蛋白的表达有较强的抑制作用.而抗病毒效果稍差的SCA723,随浓度的增加也表现出一定程度对病毒蛋白表达的抑制作用.结论 本实验所筛选的5条反义核酸SCA547、SCA551、SCA554、SCA558、SCA568能较好地抑制CVA24活性,为进一步研究反义核酸治疗和预防CVA24感染、防止CVA24引起的流行性出血性结膜炎的暴发流行打下基础.

脊髓背角中强啡肽A表达的上调对福尔马林引起的大鼠炎性水肿的影响

目的:利用鞘内注射前强啡肽mRNA的反义寡聚核苷酸,观察由福尔马林引起的大鼠后脚炎性水肿程度的变化,来证明脊髓背角中强啡肽(dynorphin,Dyn)A的量可能影响外周炎症反应的大小.方法:在3组成年Wistar大鼠(每组5只)预先在鞘内分别注入对抗前强啡肽mRNA的反义寡聚核苷酸(AS-ODN)、生理盐水(NS)、和反序的反义寡聚核苷酸(RS-ODN);4h后,再给各组动物一侧后脚掌皮下注射福尔马林(0.5%,100μl),并分别在注射后的1h、2h、3h三个时间点,各以5只动物先检查后脚掌直径,以福尔马林注射前的直径为对照,算出直径增加的百分数,作为炎性水肿变化的指标,并在脚掌检测后立即处死动物作免疫组化检测,确定各时间点大鼠两侧脊髓背角浅层中Dyn A(1-8)免疫反应样物质的光密度值.结果:①3组动物在福尔马林注射后的3个时间点,注射侧后脚掌的炎性水肿均呈进行性的加重,但在鞘内注入AS-ODN的实验组,各个时间点的水肿程度均明显地小于注射了生理盐水和RS-ODN的两个对照组;而在两个对照组相应的各时间点之间无显著性差异.②在免疫组化检测中,可看到三组动物注射侧脊髓背角中都出现Dyn A(1-8)的光密度值随测定值时间推后而增加,实验组各时间点的测定值均明显地小于两个对照组相应时间点的测定值,但后两组的各相应时间点的测定值之间无显著性差异.结论:鞘内注射反义核苷酸后福尔马林引起的脊髓中强啡肽A的表达上调被阻止,并且平行地出现了局部炎性水肿发展的被阻止.

电压依赖性钙通道α2δ-1亚基在瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏中的表达变化

目的:观察背根神经节电压依赖性钙通道α2δ-1蛋白在瑞芬太尼诱发切口痛大鼠术后痛觉过敏中表达的变化.方法:体重180～220 g雄性SD大鼠64只,采用随机数字法分为8组(n=8):对照组(C组);瑞芬太尼组(R组);切口痛组(Ⅰ组);瑞芬太尼+切口痛组(M组);切口痛+鞘内注射NS组(E组);切口痛+瑞芬太尼+NS组(F组);切口痛+瑞芬太尼+Cav α2δ-1错义寡聚核苷酸组(G组);切口痛+瑞芬太尼+Cavα2δ-1反义寡聚核苷酸组(H组).瑞芬太尼颈部皮下输注剂量为80 μg/kg(1 ml),输注时间30 min;切口痛模型为右后足掌切口,深达肌肉层;鞘内分别注射NS、Cav α2δ-1错义寡聚核苷酸、Cav α2δ-1反义寡聚核苷酸.C、R、I和M组为实验l部分,E、F、G和H组为实验2部分.各组大鼠适应环境两天,于手术前48 h、24 h(T-2、T1),手术后6h,24 h,48 h(T0-2)分别使用热辐射刺激仪和von Frey纤维丝进行热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足阈值(PWT)测定.实验2大鼠分别于造模后6h及24 h痛敏测定结束后进行鞘内注射.实验1和实验2痛敏测定完成后,取L4-6节段背根神经节,采用Western blot免疫印迹杂交法测定Cav α2δ-1蛋白的表达.结果:实验1:Ⅰ组、R组和M组的术后各时段PWL、PWT均较C组降低,且M组较Ⅰ组进一步降低,差异有统计学意义(P＜0.05);M组背根神经节Cav α2δ-1蛋白表达水平较其余各组均高,差异有统计学意义(P＜0.05).实验2:E组、F组、G组和H组的术后各时段PWL、PWT均降低,且F组、G组在Ti-2较H组进一步降低,差异有统计学意义(P＜0.05);H组背根神经节Cav α2δ-1蛋白表达水平较F组、G组降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:背根神经节Cav α2δ-1蛋白可能参与瑞芬太尼诱发切口痛大鼠的术后痛觉过敏的形成;鞘内注射Cav α2δ-1-反义寡聚核苷酸能延缓切口痛大鼠的术后痛敏.

鞘内注射TLR3反义寡聚核苷酸对脊神经结扎大鼠的镇痛作用

目的:探讨脊髓星形胶质细胞TLR3在神经病理性疼痛中的作用.方法:雄性SD大鼠,体重180～250 g.实验一:72只鞘内置管大鼠随机分为:生理盐水(Ns)20 μl脊神经结扎(SNL)(A 组),错义寡聚核苷酸(MM-ODN)20μg/d+SNL(B组),反义寡聚核苷酸(AS.ODN)20μg/d+SNL (C组).实验二:72只SNL后7天大鼠随机分为:SNL+NS 20μl(D组),SNL+MM-ODN 20μg/d(E组),SNL+AS-ODN 20μg/d(F组).实验一和实验二分别于SNL前1天和后7天开始鞘注,每天一次,共7天;于术后-1、1、3、5、7、10、14天和-1、7、10、12、14天行行为学实验.实验一和实验二分别于术后7天和14天每组各随机取6只大鼠利用免疫组织化学法观察脊髓背角GFAP的表达,并于术后-1、3、7、14天和术后7、10、14天每组各随机取6只大鼠断头处死,取L4～5脊髓节段采用RT-PCR法测定TLR3和IL-6 mRNA的表达.结果:实验一:与A组比较,C组PWPT升高并持续至术后14天(P<0.05),C组各时间点PWL无明显变化(P>0.05);与A组和B组比较,C组脊髓背角GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别下降46.4%(P<0.01)和45.7%(P<0.01);与A组和B组比较,C组鞘内注射AS-ODN抑制了TLR3受体和IL-6 mRNA的表达.实验二D组、E组和F组在PWPT、PWL、GFAP表达和TLR3及IL-6 mRNA表达方面的差异无统计学意义(P>0.05).结论:脊髓背角星形胶质细胞TLR3可能参与了神经病理性疼痛的发生与发展.

表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人结肠癌细胞的增殖

目的:建立稳定表达反义表皮生长因子受体(EGFR)的人结肠癌细胞系,研究细胞的生物学行为.方法:应用脂质体介导法将重组克隆携带反义EGFR的逆转录病毒载体转染人结肠癌细胞系LST174,利用细胞计数、生长曲线、MTT法及软琼脂集落形成率测定细胞生长、增殖及恶性表型的转化.结果:转染稳定后的细胞易脱落,细胞膜毛糙,细胞生长呈小片状,不密集.细胞继续培养后,LST174/AS-EGFR组细胞生长受到抑制,生长曲线较LST174组速度减慢,差别显著(A值:0.322±0.014vs0.422±0.033,P＜0.05);细胞生长抑制率为23.7%,LST174/AS-EGFR组细胞几乎失去了集落形成能力,且少、松散,而对照组呈叠落堆积生长.结论:反义EGFR对内源性EGFR自分泌因子表达的阻断可抑制结肠癌细胞的生长、增殖及恶性表型的转化.

反义miR-21抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖的体外研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖能力的效果和机制.方法 脂质体介导转染反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)下调U251人脑胶质瘤细胞株miR-21的表达.使用实时定量PCR和原位杂交法鉴定转染后U251细胞miB-21表达水平下调;MTY法评价AS-miR-21抑制U251细胞生长效果;流式细胞术检测转染后U251细胞周期分布和凋亡;采用细胞免疫荧光技术(PCNA、CyelinD1、Bcl-2、PTEN和Septin-7)评价转染后U251细胞肿瘤生物学性状改变.结果 MTT结果显示AS-miR-21转染组肿瘤细胞生长速度小于对照组与无义寡核苷酸(F=78.926,P=0.000)组;实时定量PCR法:AS-miR-21转染组miR-21表达下调为对照组0.042±0.012;LNA-miR-21原位杂交显示AS-miR-21转染组miR-21表达水平较对照组与无义寡核苷酸组下调;流式细胞术检测可见AS-miR-21转染组细胞周期存在G0/G1期阻滞(X2=14.160,P=0.007)且凋亡比例高于对照组与无义寡核苷酸组(F=23341.25,P=0.000);细胞免疫荧光法表明AS-miR-21治疗后U251细胞PCNA、CyclinD1、Bcl-2表达下调,PrEN、Septin-7表达上调.结论 以miR-21作为靶点抑制U251人脑胶质瘤细胞株生长结果肯定,miR-21可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.

反义寡聚核苷酸对阿片类药物药理作用的影响

阿片受体及受体后信号转导分子的反义寡聚核苷酸能影响相应阿片受体亚型激动剂的药理作用,其中包括阿片类药物的镇痛及其所致的耐受和依赖.其作用机制可能与抑制阿片受体表达,减少阿片受体量,影响受体后信号转导分子功能有关.这方面的研究对直接在分子水平探讨特定阿片受体的功能,阿片受体分型,分析阿片类药物产生镇痛、耐受和依赖等一系列药理作用的确切机制具有重要意义.

反义寡核苷酸类化合物的体内转运研究进展

反义寡聚核苷酸已成功用于对基因表达的特异性调控与抑制.但是,大多数此类化合物是呈负电性的,不能有效跨越细胞膜.到目前为止,已发展了数种提高寡聚核苷酸类化合物细胞内转运的方法.现对提高寡聚核苷酸细胞内转运的载体和方法作一较详尽的归纳.

C-fos基因的反义寡聚核苷酸在脊髓背角减弱痛行为反应和抑制fos蛋白及强啡肽A的表达:大鼠福尔马林实验

c-fos,bax和p53的反义寡聚核苷酸(ASOs)对溶血磷脂酸所致的培养小鼠大脑皮层神经元凋亡的影响

性,不同于b淀粉样蛋白片段31-35的致凋亡特性.

颅内注射c-fos反义寡聚核苷酸对急性期脑出血周边组织的DNA修复基因表达的影响

目的:研究c-fos基因对于急性期脑出血周边组织的影响及其作用机制.方法:采用在血肿中心微量注射、免疫组织化学法、原位末端标记的方法在大鼠脑出血模型上观察c-fos反义寡脱氧核苷酸(antisense obligodeoxynucleotides, antisense ODNs )对DNA修复基因表达的影响.结果:antisense ODNs能够抑制脑出血周边组织的c-fos阳性细胞表达(P＜0.01),加重了血肿周边神经元的损伤.同时,ERCC1的表达也有下降的趋势(P＜0.01),而且在c-fos表达的区域也有ERCC1的表达.结论:c-fos基因对急性期脑出血周边神经元保护作用可能与脑细胞内源性的DNA修复有关.

NR2B反义寡核苷酸对脑缺血海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响

目的:观察前脑缺血后NR2B反义寡核苷酸(ANR2B)对海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响,为临床脑血管疾病的防治以及研制特异性新药提供理论基础.方法:正常SD大鼠,脑缺血手术48 h前海马CA1区分别立体定位预注射ANR2B、NR2B正义寡核苷酸(SNR2B).后行四动脉阻断全脑缺血手术,免疫组织化学反应,观察NR2B蛋白质在ANR2B的作用下的表达变化.结果:海马CA1区立体定位注射ANR2B后,注射区及其周围NR2B免疫组织化学染色强度明显下降,仅有少量锥体细胞散在分布.结论:ANR2B可以在体局部抑制缺血早期NR2B亚单位蛋白表达上升趋势.

MicroRNA-10a通过调控MMP的表达促进胶质瘤细胞侵袭

目的:研究microRNA-10a( miR-10a)对人脑胶质瘤细胞系U87MG侵袭性的影响.方法:脂质体包被miR-10a反义寡聚核苷酸(miR-10a antisense oligodeoxynucleotide,miR-10a-anti-ODN),转染胶质瘤U87MG细胞,并设无义miRNA转染组和空白对照组,流式细胞术和荧光显微镜检测miR-10a-anti-ODN对U87MG细胞的转染效率,流式细胞术检测转染miR-10a-anti-ODN后U87MG细胞的凋亡和细胞周期,MTT法检测U87MG细胞的增殖,Transwell实验检测miR-10a-anti-ODN对U87MG细胞迁移和侵袭的影响；RT-PCR和Western blotting法分别检测U87MG细胞中MMP-2、MMP-9、MMP-14 mRNA及蛋白的表达.结果:转染miR-10a-anti-ODN后,U87MG细胞的增殖、周期和凋亡无明显改变,U87MG细胞的侵袭[(87±7.1)vs (155±3.7)、(149±6.6)个细胞,P＜0.05]和迁移[(78.0±5.2)vs (150.3±3.7)、(147.3±6.6)个细胞,P＜0.05]能力明显下降,侵袭相关因子MM-2、MMP-9、MMP-14的mRNA及蛋白表达水平也明显下降.结论:miR-10a通过调控MMP-2、MMP-9、MMP-14的表达促进胶质瘤U87MG细胞的侵袭,miR-10a可能是胶质瘤治疗的潜在靶点.

c-fos反义寡聚核苷酸对脑缺血性损伤和电针抗损伤作用的影响

用c-fos反义寡聚核苷酸脑内微量注射、TTC染色、c-Fos免疫组织化学和电针等技术和方法,探讨即早反应基因c-fos在大鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型的脑损伤中和电针抗局灶性脑缺血脑损伤中所起的作用.实验结果表明,局灶性脑缺血可引起c-fos在缺血侧皮质的大量表达,电针能部分抑制这种表达,使脑缺血梗死灶体积减小.在缺血中心区注射c-fos反义寡聚核苷酸后,脑内c-fos的表达基本上被完全阻断,导致脑梗死灶的体积明显增大,电针抗脑缺血脑损伤的作用也被取消.提示脑缺血后,脑内的c-fos适度表达可能对脑损伤有一定的保护作用;电针可能部分抑制了脑内c-fos表达,调整了缺血后的c-fos表达的程度,对脑缺血损伤起一定的保护作用.

反义寡聚核苷酸的化学修饰

反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotides, AS-ODNs)的概念先提出于1967年,经过30多年的研究,人们已意识到在各种反义寡聚核苷酸的广阔领域里,有可能寻找到更有效的抗病毒和抗肿瘤新药.

侧脑室注射μ-阿片受体反义寡聚核苷酸对小鼠甲基苯丙胺行为敏化反应的影响

目的 探讨μ-阿片受体(μ-opioid receptor,MOR)在小鼠甲基苯丙胺行为敏化中的作用.方法 人工合成反义及错配反义MOR基因片断,通过对小鼠自主活动行为的检测,观测侧脑室注射MOR反义寡聚核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对急性甲基苯丙胺活动增强效应及慢性甲基苯丙胺诱导的小鼠行为敏化形成的影响.结果 MORASODN可显著降低甲基苯丙胺的急性高活动效应,并可阻断甲基苯丙胺诱导小鼠行为敏化的形成.结论 MORASODN对中枢神经系统功能具有抑制作用,可抑制甲基苯丙胺诱导小鼠行为敏化的形成过程,提示MOR介导对甲基苯丙胺的成瘾行为的调控作用.

反义寡聚核苷酸治疗支气管哮喘的实验研究

目的探讨反义寡聚核苷酸治疗支气管哮喘的可能性及效果。方法根据小鼠IL-5 cDNA序列设计合成反义寡聚核苷酸片段，用T4噬菌体多核苷酸激酶标记反义寡聚核苷酸的5′端，观察硬脂胺(SA)脂质体对反义寡聚核苷酸的转染效率的影响。用卵蛋白和氢氧化铝复制哮喘模型。用聚酰纤维分离小鼠脾T淋巴细胞进行体外培养并导入由阳离子脂质体携带的不同浓度的反义寡聚核苷酸，观察其对T淋巴细胞合成IL-5的影响。采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清液中IL-5浓度。结果 SA脂质体能显著提高反义寡聚核苷酸的转染效率，1∶15 m/m(反义寡聚核苷酸和SA脂质体质量比)时转染效率佳，提高反义寡聚核苷酸转染效率12倍。未经卵蛋白刺激的正常鼠和哮喘鼠T淋巴细胞培养上清液中未测到IL-5，经卵蛋白刺激后，T淋巴细胞培养上清液中IL-5含量明显增高。导入不同浓度的反义寡聚核苷酸(10、20及30 μmol/L)后，脾T淋巴细胞合成IL-5明显降低，细胞培养上清液中IL-5含量由(44.60±6.23)pg/ml分别降低到(30.70±7.362)、(17.20±6.181)和(8.16±2.34)pg/ml，抑制IL-5合成百分率分别为31.17%、61.43%和81.7%。结论反义寡聚核苷酸可明显抑制IL-5的合成，且呈明显的量效关系。支持其通过抑制致敏小鼠T淋巴细胞IL-5的转录而抑制其合成，为反义基因治疗哮喘提供了依据

反义miR-21通过调控hTERT表达抑制胶质瘤细胞生长

目的 探讨敲低miR-21表达对人胶质瘤细胞系U87细胞功能的影响以及相关作用机制.方法 脂质体介导转染miR-21反义寡聚核苷酸(miR-21 inhibitor)敲低U87细胞miR-21的表达.使用实时荧光定量PCR鉴定转染后U87细胞miR-21表达水平；MTT法检测转染后细胞增殖水平,流式法评价转染后细胞周期分布及凋亡变化,并结合Western印迹及RT-PCR验证在U87细胞中miR-21和hTERT间关系.结果 体外转染反义miR-21寡聚核苷酸能明显抑制U87细胞生长,诱导其凋亡,并且能够明显下调hTERT表达.结论 反义miR-21可能通过下调hTERT表达抑制胶质细胞生长,miR-21可作为胶质瘤基因治疗的靶点.