首页 > 文献资料
-
hTERT启动子调控的异种抗原基因α-1,3GT表达载体的构建及其在肺癌细胞中的靶向表达
目的:构建人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控的异种移植抗原α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3 galactosyltransferase, α-1,3GT)基因真核表达载体,研究其调控的α-1,3GT在肿瘤细胞中的靶向表达.方法:将前期克隆并测序正确的猪α-1,3GT基因定向克隆到pEGFP-hTERTp质粒中, 构建α-1,3GT真核表达载体pEGFP-hTERTp-GT.分别将pEGFP-hTERTp-GT和CMV启动子调控的α-1,3GT真核表达质粒pEGFP-N1-GT转染端粒酶阳性的人肺癌细胞A549及端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5.RT-PCR检测转染细胞中α-1,3GT mRNA的表达,免疫荧光法和流式细胞仪检测α-gal抗原的表达.结果:成功构建了pEGFP-hTERTp-GT真核表达载体.转染pEGFP-N1-GT的A549和MRC-5中均有α-1,3GT mRNA的表达;转染pEGFP-hTERTp-GT的A549中有α-1,3GT mRNA的表达,而端粒酶阴性的MRC-5细胞中无α-1,3GT mRNA的表达.转染pEGFP-N1-GT的A549和MRC-5中均可表达异种移植抗原α-gal;转染pEGFP-hTERTp-GT质粒的A549中有α-gal的表达,而MRC-5细胞中无α-gal的表达(P<0.01).结论:hTERT启动子调控的α-1,3GT基因能靶向性表达在端粒酶阳性的肺癌细胞中,并合成异种移植抗原α-gal.
-
p3GnT8/β3GalT7催化活性的研究
目的 进一步验证β1,3半乳糖基转移酶(β3GalT7)的催化功能.方法 将重组表达载体pGEX-6p-1-β3GnT8/GalT7转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,得到GST-β3GnT8/GalT7融合蛋白,分别进行β3GAIT7和β3GnT8反应体系的酶促反应,利用高效液相色谱(HPLC)进行检测.结果 HPLC检测结果表明,β3GalIT7同时具有β3GalT7和β3GnT8的活性.结论 β3GalT7具有双重酶活性,拟初步重命名为β3GnT8/β3GalT7.
关键词： β1 3半乳糖基转移酶 3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 催化活性 高效液相色谱 -
β3GnT8/β3GalT7表达载体构建及其功能
目的 探讨β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶/β1,3半乳糖基转移酶(β3GnT8/β3GalT7)与肿瘤浸润、转移的相关性.方法 构建并鉴定β3GnT8正义和反义表达载体.将空载体(A组)、正义(B组)及反义(C组)重组载体分别转染人胃癌SGC7901细胞中;另设SGC7901细胞为对照(D)组.采用RT-PCR和Western blot法分别检测四组细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-14和转化生长因子β1 (TGF-β1)的mRNA和蛋白表达.结果 获得β3GnT8/β3GalT7基因正义和反义表达载体,并成功转染SGC7901细胞.D组TGF-β1、MMP-2和MMP-14表达低于B组,但高于C组.结论β3GnT8/β3GalT7表达与MMP-2、MMP-14和TGF-β1阻表达呈正相关,故可能参与肿瘤的发生、发展过程.
-
ABO亚型分析及基因测序研究方法的建立
目的:建立一种ABO血型基因的测序检测方法,对ABO血型的基因突变位点进行分析,并对ABO亚型进行准确分型.方法:采用PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)技术,选取特异性引物对ABO基因的第6、7外显子及第6内含子进行扩增,并用PCR直接测序方法对该序列进行分析,在此基础之上,用该方法对经血清学鉴定为亚型的样本进行检测.结果:建立的PCR产物直接测序方法,能够准确的对ABO基因的第6、7外显子序列进行分析,并通过此方法鉴定了1例B亚型,其基因型为B/O杂合,其中α-1,3半乳糖基转移酶基因在第7外显子上发生第721位C＞T突变,导致了多肽链Arg241Trp的替换.结论:建立了一种ABO血型基因产物的PCR直接测序方法,并对ABO亚型进行了分析,为以后血型鉴定及其亚型分子机制的研究奠定了基础.
-
α1,3半乳糖基转移酶新等位基因278C＞T的鉴定
目的 研究中国汉族人群ABO血型系统中Bw变异型的分子遗传背景,发现并鉴定一个新的ABO等位基因. 方法 血型血清学方法鉴定1例ABO血型疑难样本,应用聚合酶链反应、逆转录-聚合酶链反应和DNA序列分析等方法对先证者ABO基因转录调控序列和全编码序列进行突变筛选和检测. 结果 血清学和家系调查鉴定该样本为Bw表型,对gDNA和cDNA研究发现该样本存在第6外显子278C/T杂合,单倍体分析发现一种新的Bw等位基因,该等位基因与B101相比,差异仅在第6外显子的278C＞T错义突变,导致多肽链P93L替换,该突变点位于以前报道的Bw等位基因功能域之外.结论 在中国人群中发现一种新的导致Bw变异型的ABO等位基因.
-
α1,3半乳糖基转移酶基因721C>T突变导致Bw亚型
目的研究红细胞ABO血型系统Bw亚型的分子基础. 方法通过标准血型血清学方法明确鉴定2个家庭3例Bw亚型,PCR扩增Bw亚型ABO糖基转移酶基因的增强子、启动子和第1～7外显子及侧翼内含子序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序.同时将第6和7外显子克隆到pcDNA3.1(-)质粒,转化DH5α后进行序列分析.采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法证实测序所发现的突变.结果直接测序发现3例Bw亚型的基因型为B/O杂合,其中糖基转移酶基因的第261位G杂合缺失,第721位C/T杂合.克隆证实一条染色体上为正常的O等位基因,另一条染色体上B等位基因(α1,3半乳糖基转移酶基因)存在第721位C>T突变,导致多肽链Arg241Trp替换.序列特异性引物-聚合酶链反应检测140份随机样本未发现此突变. 结论α1,3半乳糖基转移酶基因第7外显子721C>T突变可能是Bw亚型分子遗传基础之一.
-
两例ABO变异型Bw亚型的分子遗传学分析
目的 研究ABO变异型Bw亚型的分子生物学特性.方法 通过标准血型血清学方法鉴定2例Bw亚型,采用聚合酶链反应-序列特异性(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)技术进行ABO基因分型,特异性扩增B基因第6～7外显子,PCR产物纯化后直接测序分析.结果 血清学鉴定2例Bw亚型,PCR-SSP结果显示样本基因型为B/O2.B基因直接测序结果发现1例与B101序列比对第7外显子存在721C＞T突变,导致多肽链R241S替换;另1例与B101比对第6外显子存在278C＞T突变,导致多肽链P93L替换.结论 发现Bw03、Bwl2亚型各1例,其表达B抗原的强弱存在差异.
-
α-1,3半乳糖基转移酶基因c.1055G＞A突变导致ABO亚型ABw07的分子生物学研究
目的 探讨1例ABO血型系统ABw07亚型的分子生物学机制.方法 选择2014年3月12日于青岛市中心血站献血的1例ABO正反定型不符的疑难血型无偿献血者为研究对象.采用试管法对其进行血型血清学检测;采用PCR-序列特异性引物(SSP)法对其ABO基因进行分型,并且对其ABO基因第6、7外显子扩增后,进行直接测序及克隆测序,确定其ABO基因型.结果 ①本例献血者血型血清学检测结果显示,正定型为AB型,反定型为A型.②本例献血者ABO基因第6、7外显子的直接测序结果显示,ABO基因第261位脱氧核糖核苷酸无缺失,存在c.297A＞G、c.467C＞T、c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C、c.930G＞A及c.1055G＞A杂合突变.③单克隆测序结果显示,本例献血者的ABO基因存在c.1055G＞A突变,导致密码子由CGG突变为CAG,所编码的第352位氨基酸精氨酸突变为谷氨酰胺(p.Arg352Gln),ABO基因型为A102/Bw07.结论 α-1,3半乳糖基转移酶基因(B基因)c.1055G＞A(p.Arg352Gln)突变可能导致产生ABw07亚型,该亚型血型个体的血清中存在抗-B.
-
VEGF 启动子介导鼠α1,3半乳糖基转移酶表达及其对缺氧的人肝癌细胞HepG2的靶向杀伤效应
目的:利用血管内皮生长因子(VEGF)基因启动子介导鼠α1,3半乳糖基转移酶(α1,3 GT)在缺氧肝癌细胞HepG2中靶向表达并检测其诱导的人血清天然抗体对肝癌细胞的杀伤效应,为肝癌的靶向基因治疗方法提供新的思路.方法:利用PCR从Balb/c 小鼠肝组织中扩增出小鼠VEGF 基因启动子片段并插入到荧光素酶报告载体中;用所构建的荧光素酶报告载体瞬时转染 HepG2 细胞;经缺氧诱导后检测转染细胞中荧光素酶活性;进一步通过基因重组构建受VEGF 基因启动子调控的鼠α1,3GT重组逆转录病毒载体并稳定转染HepG2细胞;转染细胞在缺氧条件下培养后,通过CDCC试验检测人血清对转染细胞的杀伤效应.结果:在转染重组有VEGF 基因启动子的荧光素酶报告载体的HepG2中,荧光素酶的活性是对照组的2-3倍;通过CDCC实验发现转染有鼠α1,3GT重组逆转录病毒载体的HepG2细胞经缺氧培养后对人血清的杀伤效应更加敏感.结论:利用VEGF基因启动子介导鼠α1,3GT在缺氧肿瘤细胞中靶向表达并诱导人血清天然抗体对肿瘤细胞产生杀伤效应在肿瘤的靶向基因治疗中具有潜在的临床应用价值.
