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毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建及表达分析
为了探索利用毕赤氏酵母系统表达和生产人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,hGM-CSF)的可行性,使用经改造的hGM-CSF基因构建pGAPZα-A/hGM-CSF分泌型表达载体,转入毕赤氏酵母SMD1168(his 4,pep 4)菌株和GS115(his 4)菌株,利用斑点杂交技术筛选hGM-CSF基因阳性菌株,利用SDS-PAGE和TF-1依赖细胞株/MTT比色法对工程菌株的分泌产物进行表达和生物活性分析,后筛选得到7个hGM-CSF基因阳性菌株,其中有3个工程菌株的杂蛋白较少且主带蛋白质相对分子质量与经改造的hGM-CSF基因相对分子质量保持一致,这3个工程菌株的分泌蛋白质样品都具有天然hGM-CSF的生物活性,经初步提取,活性单位分别为2.28×105U/ml、2.22×105U/ml和2.46×105U/ml.从而证明利用毕赤氏酵母系统表达hGM-CSF是可行的,为hGM-CSF的生产和临床应用打下了基础.
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四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆
目的：应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法：将四环素抗性基因（TetR）克隆到载体pBV220中构建筛选载体pBV223；根据氨基酸密码子的简并性，在保持原有氨基酸序列不变的情况下，人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库，以hGM-CSF基因为例进行筛选。把hGM-CSF cDNA简并文库克隆到pBV223中的TetR上游位置，构建pBV223/hGM-CSF克隆文库，导入大肠杆菌DH5α中，构建转基因的细菌文库，在不同质量浓度（20 mg/L,40 mg/L,50 mg/L,60 mg/L）的四环素培养基中培养。结果:从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV223/hGM-CSF克隆，测序结果显示该克隆的hGM-CSF cDNA 5′端序列与天然序列比较有7个碱基发生突变，且符合实验设计的要求。通过基因重组，构建成终的高效表达克隆pBV220/hGM-CSF ，其表达hGM-CSF 的量占细菌总量的18%，较原表达水平提高80%。结论:可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。
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肾癌G250基因和hGM-CSF基因双顺反子表达质粒的构建及鉴定
目的 应用分子生物学技术,构建pIG250-GM双顺反子真核表达质粒并进行测序鉴定.方法 从肾癌组织中提取总KNA,采用RT PCR技术扩增肾癌G250抗原的基因编码区序列,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐荆hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIG250-GM真核表达质粒,并进行酶切鉴定.结果 酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.44kμ和0.47kμ,测序分析表明克隆的G250和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致.结论 成功构建双顺反子表达pIGM-G250质粒,为研究G250-GMCSF基因负载的DC疫苗防治肾癌提供了必要的实验基础.
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表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立
目的 建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系.方法 通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的 蛋白在HEK293细胞中的表达.结果 经600 μg/mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞；ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符.结论 成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础.
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人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达
[目的]构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定.[方法]采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B(MCSB)中,构建pIGM-CSF真核表达载体.然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达.[结果]所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达.[结论]成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础.
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结核杆菌Esat6与hGM-CSF双顺反子表达载体的构建及鉴定
目的 从质粒pVAE中克隆目的基因Esat6,与hGM-CSF一起构建双顺反子表达载体pIEG,并进行鉴定.方法 以质粒pVAE为模板扩增出Esat6基因,与pIRES的MCS A进行重组,构建pIEsat6重组质粒.然后再以pORF-hGM-CSF为模板扩增出hGM-CSF基因,与pIRES载体的MCS B进行重组,构建pIGM重组质粒,上述两重组质粒经PCR、限制性内切酶图谱及DNA序列测定分析等多种方法进行鉴定后,再通过酶切、连接把hGM-CSF构建于pIEsat6质粒中,形成双顺反子真核表达载体pIEG.结果 通过PCR可克隆得到相应大小的产物,酶切鉴定所切下的两片段大小约为0.29 kb和0.47 kb,与预计相符.测序结果与报道一致.结论 成功构建结核杆菌Esat6基因与hGM-CSF双顺反子真核表达载体,为进一步研究其结核融合DNA疫苗及其转染DC疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.
