pVR-IL15基因佐剂对表达HBsAg重组病毒免疫效果的影响

目的 探索pVR-IL15基因佐剂在表达HBsAg病毒治疗型疫苗的不同免疫策略中对免疫应答的影响.方法 采用了携带乙肝病毒S基因片段的DNA、重组Ankara痘病毒和重组腺病毒序贯免疫策略免疫BALB/c小鼠,在序贯免疫策略的基础上联合pVR-IL15免疫.用ELISA和IFN-γELISPOT方法检测不同免疫组别中小鼠的细胞免疫和体液免疫反应强度.结果 联合pVR-IL15免疫组的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平均显著高于无联合pVR-IL15免疫组,差异具有统计学意义.结论 pVR-IL15基因佐剂能够增强表达HBsAg重组病毒诱导的小鼠免疫应答.

细胞因子作为DNA疫苗基因佐剂的研究进展和探索

20世纪90年代以来,伴随着基因治疗技术的发展,产生了一种新型疫苗--DNA疫苗,又称核酸疫苗.DNA疫苗就是运用克隆技术把编码某种特异抗原的外源基因连接到真核表达载体上,利用重组的质粒DNA免疫机体,使外源基因在活体内表达.

DNA疫苗的研究现状

DNA疫苗的概念提出已有十几年的时间,其间针对DNA疫苗的研究工作取得了很大进展,其有效性已在动物体内得到了验证,而且部分疫苗已进入临床试验阶段,但在取得进展的同时也遇到了许多制约其发展的难题.本文对DNA疫苗发展现状,遇到的问题,采取的策略及可能引起的副反应加以综述.

基因佐剂在核酸疫苗中的应用

基因佐剂是指将某些分子的基因,与核酸疫苗所编码的抗原基因共同应用于机体后,这些分子基因的表达产物(与抗原融合或非融合两种形式),可通过募集和活化淋巴细胞,促进疫苗编码抗原的摄取、加工和提呈,刺激协同刺激分子表达和细胞因子分泌等作用,调节疫苗编码抗原所诱导的免疫应答的大小和方向,提高核酸疫苗的效力.目前,应用于核酸疫苗的基因佐剂主要有以下几种:

基因佐剂结核杆菌HSP70增强HCA661基因疫苗免疫应答

目的:评价结核分枝杆菌HSP70(Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mtHSV70)羧基端作为基因佐剂对HCA661(Hepatocellular carcinoma associated antigens 661)基因疫苗免疫效果的影响.方法:将HCA661及与mtHSP70羧基端的串联体分别克隆到pCI-neo中构建基因疫苗;将eGFP及与mtHSP70羧基端的串联体分别克隆到pCI-neo,体外转染ψA细胞,根据eGFP的表达评价重组质粒中靶基因的转录表达效率.基因疫苗免疫BALB/c 小鼠,SABC、Western blot检测免疫血清中特异性HCA661抗体;流式细胞术、ELISA法检测免疫血清中特异性HCA661抗体水平.结果:重组质粒构建成功;80%ψA细胞转染eGFP后呈现绿色荧光;单基因和融合基因疫苗组动物均产生了针对HCA661的特异性抗体,融合疫苗组诱导的抗体水平较单基因疫苗组显著增高,融合基因疫苗组未产生针对mtHSP70的抗体.结论:mtHSP70羧基端作为基因佐剂增强机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答.

结核杆菌热休克蛋白70刺激表位在融合基因疫苗中的佐剂作用

目的:探讨结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661(HCA661)融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据.方法:18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组,每组6只,分别肌肉注射100μg空质粒pCI-neo、重组质粒pCI-HCA661-mtHSP70C和pCI-HCA661-mtHSP70E,流式细胞术分析小鼠脾T细胞亚群变化;ELISA法检测体外培养脾细胞上清中干扰素γ(IFNγ)的含量及免疫小鼠血清中HCA661特异性抗体的滴度;体外特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤试验观察融合基因疫苗对肿瘤细胞的抑制作用.结果:pCI- HCA661-mt HSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+T淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+比值与pCI-neo组比较差异有统计学意义(P＜0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值均高于pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组,差异有统计学意义(P＜0.05);在抗原肽刺激下,pCI- HCA661 - HSP70E免疫组小鼠脾细胞培养上清中IFNγ含量较pCI-mtHCA661-HSP70C免疫组明显提高(P＜0.05);pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA66 1-mt HSP70E免疫组IFNγ含量均高于pCI-neo组(P＜0.05).pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组诱导的HCA661特异性抗体水平较pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组显著增高(P＜0.05); pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组可以产生更强的CTL抗肿瘤效应.结论:mtHSP70刺激表位可以诱导机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答,发挥更强的佐剂作用.

重组人IL-12真核表达载体的基因佐剂功能

目的 探讨重组人IL-12真核表达载体(pcDNA6-p70)对核酸疫苗(HCMV pp65基因重组腺病毒,Adeno-pp65)的基因佐剂功能.方法 PcDNA6-p70与Adeno.pp65共免疫BALB/c小鼠,每2周1次,共4次,同时设立Adeno-pp65对照组及生理盐水对照组.于初次免疫后第6周末尾静脉取血,第9周处死小鼠,分离脾细胞,分别检测细胞内细胞因子水平、CTL杀伤活性、特异性淋巴细胞增生和IFN-γ水平,并观察pcDNA6-p70对小鼠的安全性.结果 共免疫组HCMV特异性CIM/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于Adeno-pp65组及生理盐水对照组,差异均有显著意义;其CTL杀伤活性、HCMV特异性淋巴细胞增生水平及脾淋巴细胞特异性IFN-γ释放水平均高于Adeno-pp65组和生理盐水对照组,差异均有显著意义.pcDNA6-p70肌肉注射昆明小鼠,其体温、体重及一般情况与对照组差异均无显著意义.结论 pcDNA6-p70与Aden-pp65共免疫可提高核酸疫苗的免疫效果,且具有较好的安全性.

霍乱病毒B亚单位作为基因佐剂对单纯疱疹病毒2型DNA疫苗免疫效果的影响

目的 研究霍乱病毒B亚单位(cholera toxin subunit B,CTB)作为基因佐剂对单纯疱疹病毒2型(herpes sim-plex virus type 2,HSV-2)DNA疫苗pgD免疫效果的影响.方法 将CTB片段克隆至真核表达质粒pcDNA3Kan(pKan)中,构建基因佐剂pcDNA3Kan-CTB(pCTB).将BALB/c小鼠随机分为pCTB无疫苗组、pgD/pCTB佐剂组、pgD/pKan空载体组及PBS对照组,经后腿肌肉多点注射,共免疫3次,每次间隔2周.于末次免疫2周后,经小鼠眼球采血,分离血清,ELISA法检测HSV-2特异性IgG水平及IgG1、IgG2a亚型抗体滴度;制备小鼠脾细胞,MTS法检测小鼠脾脏T细胞增殖能力;将病毒稀释后经腹腔接种小鼠,于免疫2周后,进行HSV-2致死剂量攻毒试验.结果 pCTB经双酶切及测序鉴定证明构建正确;pgD/pCTB佐剂组小鼠血清中HSV-2特异性IgG水平明显高于其他3组(P＜0.001),IgG1和IgG2a滴度均明显高于pgD/pKan空载体组(P＜0.001),其中IgG2a增幅更明显,IgG2a/IgG1比值与pgD/pKan空载体组相比,由(1.176±0.11)增加至(1.316±0.07)(P＜0.05);pgD/pCTB佐剂组小鼠脾细胞在HSV-2刺激下诱导的特异性T细胞增殖反应明显强于PBS对照组及pgD/pKan空载体组(P＜0.05);攻毒14d内,pgD/pCTB佐剂组小鼠存活率高达100％.结论 pCTB作为基因佐剂能够显著提高pgD诱导小鼠产生抗原特异性IgG抗体水平,增强HSV-2特异性T细胞增殖反应,并介导以细胞免疫为主的Th1/Th2混合型免疫反应.

白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响

目的研究白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响.方法利用分子生物学技术构建含IL-2基因的重组质粒pcDNA3.1/IL-2,经测序鉴定、碱裂解法大量提取及Sepharose 4FF柱层析纯化,得到重组质粒pcDNA3.1/IL-2和pcDNA3.1/S,免疫豚鼠后,经ELISA检测豚鼠血清中抗HBsAg滴度,CTLL-2细胞株/MTT法检测IL-2活性.结果序列测定和分析结果表明重组质粒pcDNA3.1/IL-2构建正确.血清中抗HBsAg抗体滴度:铝佐剂+HBsAg组为2 116 mIU;IL-2+HBsAg组为1 987 mIU;质粒pcDNA3.1/IL-2+HBsAg组为2 252 mIU;质粒pcDNA3.1+IL-2+pcDNA3.1/S组为67.19 mIU;质粒pcDNA3.1/S组为50.88 mIU.重组质粒pcDNA3.1/IL-2免疫1周后,IL-2表达水平达高峰,以后逐渐降低,但1个月后IL-2水平仍高于空白对照组.对抗HBsAg抗体滴度和IL-2活性的检测结果进行统计学分析表明,各组间差异有显著意义(P＜0.05).结论 IL-2基因佐剂可以增强乙肝重组疫苗和乙肝DNA疫苗的免疫效果.

基因佐剂在DNA 疫苗中的应用

基因佐剂可将编码某些具有佐剂作用成分的基因与DNA疫苗共免疫,在体内表达相应的蛋白,增强T、B细胞对疫苗成份的体液及细胞免疫应答.目前研究较多的基因佐剂有:细胞因子基因佐剂如IL-12、IL-2、IFN-γ、GM-CSF等;共刺激分子基因佐剂如 B7-2、CD40L 等;免疫刺激DNA序列基因佐剂如CpG、ODN 等.基因佐剂在体内与疫苗基因共表达,改善抗原的周边微环境,提高疫苗的免疫效果.因此,基因佐剂是目前DNA疫苗研究中的热点问题之一.

080 细胞因子基因佐剂对抗结核杆菌热休克蛋白65的DNA接种的影响

002 由病毒GM-CSF转基因佐剂增强BCG的免疫原性

125 Th1型基因佐剂对新生鼠免疫应答的调节

增强HIV DNA疫苗免疫原性研究

目前艾滋病(AIDS)的流行已成为世界范围的卫生问题，尤其在发展中国家，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染率不断上升。因而，发展安全有效的AIDS疫苗迫在眉睫。HIV DNA疫苗可诱导细胞免疫和体液免疫，但单用HIV DNA疫苗不能保护动物抵御HIV的侵袭，如何增强DNA疫苗的免疫原性是目前研究的中心问题。作者综述了近几年国际上在增强HIV DNA疫苗免疫原性方面所作的研究。

细胞因子类基因佐剂研究进展

细胞因子在免疫应答的产生和调节中具有重要作用,可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果.近年来,以重组质粒表达的细胞因子--即可在体内持久表达细胞因子的一类新型疫苗分子佐剂,在DNA疫苗研究领域引起广泛的兴趣与关注.本文简述了此基因佐剂用于艾滋病、乙肝、癌症和其他多种感染性疾病的DNA疫苗的研究现状,介绍了其对DNA疫苗的调制效应及其在疫苗优化、免疫防治和DNA疫苗作用机制探索中的意义.

弓形虫表面抗原SAG3基因和IL-2基因佐剂混合诱导小鼠免疫应答研究

目的了解编码SAG3的重组质粒和IL-2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应,为进一步的核酸疫苗及免疫学研究创造条件.方法将编码SAG3的质粒和鼠源性IL-2表达载体以100μg的剂量感染小鼠,3周中两次以相同的剂量加强免疫,分别以PBS和空质粒pcDNA3.1感染.采用ELISA法测定抗体水平、亚型、IFN-γ、IL-4和IL-2的含量,RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录,所有鼠均由强毒力ZS2株弓形虫感染.结果 SAG3表达质粒3次免疫后鼠体内特异IgG水平明显上升,IL-2表达质粒的联合使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次免疫15天后,目的基因在肌肉组织中仍有表达;混合质粒注射和小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长.结论由SAG3 DNA诱导的免疫应答因IL-2表达质粒的共同注射而增强,DNA疫苗和适当细胞因子的共注射对抵抗弓形虫感染的效果值得进一步研究.

DNA疫苗与肿瘤免疫

肿瘤DNA疫苗是近年来发展起来的新一代疫苗,因其能诱发有效而持久的免疫反应,因此在治疗恶性肿瘤中被广泛研究.DNA疫苗的抗肿瘤机制包括直接诱导特异抗肿瘤作用和间接增强机体免疫反应.目前已构建出多种肿瘤DNA疫苗,如根据胚胎抗原构建的DNA疫苗、独特型DNA疫苗及根据病毒相关抗原构建的DAN疫苗等.基因佐剂可将编码某些细胞因子及T、B细胞表面共刺激因子等的基因与目的 基因克隆于同一载体或不同载体共同免疫动物,其表达的相应蛋白起到佐剂的作用,可大大增强T、B细胞的免疫应答水平.肿瘤DNA疫苗对人类肿瘤治疗与预防的有效性和安全性将是未来研究的重点.

细胞因子和趋化因子作为DNA疫苗基因佐剂的研究进展

1990年第1次报道了编码外源抗原的裸露质粒DNA(naked plasmid DNA)注射小鼠后可以在体内表达抗原基因[1].尔后,一系列动物实验证明DNA疫苗能诱导针对其所编码抗原的体液或细胞免疫.

肾癌G250基因和hGM-CSF基因双顺反子表达质粒的构建及鉴定

目的 应用分子生物学技术,构建pIG250-GM双顺反子真核表达质粒并进行测序鉴定.方法 从肾癌组织中提取总KNA,采用RT PCR技术扩增肾癌G250抗原的基因编码区序列,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐荆hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIG250-GM真核表达质粒,并进行酶切鉴定.结果 酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.44kμ和0.47kμ,测序分析表明克隆的G250和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致.结论 成功构建双顺反子表达pIGM-G250质粒,为研究G250-GMCSF基因负载的DC疫苗防治肾癌提供了必要的实验基础.

SAG1和IL-2基因佐剂混合免疫诱导鼠抗弓形虫感染的研究

目的了解编码SAG1的重组质粒和IL-2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应,评价该疫苗对弓形虫的保护作用.方法编码SAG1的质粒和鼠源性IL-2表达载体以100μg的剂量免疫小鼠,3w后两次以相同的剂量加强免疫,分别以PBS和空质粒pcDNA3感染.采用ELISA法测定抗体水平、亚型、IFN-γ和IL-4的含量,PCR及原位杂交检测感染鼠中DNA的整合及降解.所有鼠均由强毒力RH株弓形虫感染.结果 SAG1表达质粒3次免疫后鼠体内特异IgG水平明显增高,IL-2表达质粒的联合使用导致IgG2a水平升高和IFN-γ的产生.混合质粒注射的小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长.结论由SAG1 DNA诱导的免疫应答因IL-2表达质粒的共同注射而增强,DNA疫苗和适当细胞因子的共注射对抵抗弓形虫感染的效果值得进一步研究.