多肽在新生儿抗感染中的研究进展

新生儿感染是引起新生儿发病及死亡的重要原因,尤其是极低出生体重早产儿.新生儿由于免疫系统发育不成熟,较容易受到病原体的入侵,引发不同的感染性疾病.在我国新生儿感染中,感染性肺炎为常见,其次是败血症和肠道感染,严重损害新生儿的健康.由于多肽较强的广谱性抗菌作用以及进化上的保守性使其成为广泛研究的热点.已有多项研究证实多肽在新生儿抗感染中的作用,并且能够抑制耐药性细菌,有望为新生儿抗感染治疗提供新方法.本文将对多肽在新生儿感染引发的肺炎、败血症、坏死性小肠结肠炎中的研究进展做进一步阐述.

多肽在肥胖研究中的新趋势

多肽是由氨基酸通过肽键相连而成的一类化学活性物质.生物体内已发现的多肽种类达数万种,具有一定生理活性.多肽作为神经-内分泌系统调控的信号分子,在肥胖及相关并发症中的作用得到广泛揭示,如神经肽Y、脑肠肽、胰高血糖素样肽等.近年,多肽组学的快速发展给多肽研究再添新概念,其中非编码基因短开放阅读框编码、功能肽同源区域、大蛋白分子断裂片段等来源的多肽以及脂肪细胞自身产生的内源性多肽也开始引起研究者的重视.本文就多肽在肥胖中的研究进展和趋势展开综述,为肥胖的预防和治疗提供了新的靶点.

肽学研究的新发现与研究进展

多肽是一种介于氨基酸和蛋白质之间、具有其独特生物学活性的化合物,依据其来源不同分为内源性多肽和外源性多肽.内源性多肽含量丰富、产生形式多样,受到研究者的关注.近期发现非编码基因同样可以编码具有生物活性的小分子肽,从lncRNA、rRNA、microRNA等寻找新的具有编码功能的开放阅读框成为新近研究的热点.内源性多肽作用方式多样,不仅可以分泌后通过与受体结合发挥类似激素的作用,也可以产生后在胞内发挥功能.随着多肽作为药物越来越多地应用于临床,内源性多肽无疑具有广泛的应用前景.本文介绍内源多肽的产生和作用方式,重点综述新的研究发现和研究进展,旨在为内源性多肽的研究提供参考.

表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽(PAP114-128)的PP7噬菌体样颗粒的制备及其活性验证

目的 获得表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽片段(PAP114-128)的PP7噬菌体样颗粒,并证实其保留原有的生物活性.方法 用基因突变和重叠PCR技术扩增出PP7衣壳蛋白单链二聚体(简称为2PP7)基因,将其插入到载体pETDuet-1中,获得质粒pETDuet-2PP7,然后通过普通PCR获得携带有PAP114-128编码基因的PP7衣壳蛋白基因,将其插入到质粒pETDuet-2PP7中,获得质粒pETDuet-2PP7-PAP114-128;将上述重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达产物用SDS-PAGE、双向免疫扩散以及ELISA进行鉴定.结果 以Ex Taq DNA聚合酶行重叠PCR可获得2PP7基因,其表达产物衣壳蛋白单链二聚体与野生型PP7噬菌体衣壳蛋白的抗原性相同;展示于PP7噬菌体样颗粒表面的PAP114-128表位与天然的人PAP蛋白相应表位无异,且能诱导较高水平的抗体产生.结论 含重复序列的2PP7基因可通过将基因突变和重叠PCR技术联用获得,且以其为基础成功制备表面展示有PAP114-128的PP7噬菌体样颗粒,不仅可解决多肽不稳定的问题,也为研究多肽的递送及功能奠定基础.

SARS病毒Spike蛋白具有中和活性的抗原表位预测和初步鉴定

目的:预测并合成SARS病毒Spike蛋白中具有中和活性的抗原表位,鉴定其在免疫检测和疫苗设计中的作用.方法:使用二级结构以及基因组对比预测方法,预测Spike蛋白中具有较高抗原活性的肽段序列并人工合成.用直接ELISA法检测在SARS确诊阳性患者血清和健康人血清之间相应抗体的检出差别,确定预测肽段是否为SARS的抗原肽段.结果:预测并人工合成了具有抗原活性的GEVFNATKFPSVYAW多肽,在ELISA检测中,可检测出SARS阳性血清中的针对性抗体,阳性符合率为71.4%,在健康人血清中不能检测出对应的抗体,阴性符合率为92%.结论:预测并合成了具有SARS病毒Spike蛋白的中和表位抗原,其特异性高于全病毒抗原,为SARS的诊断及疫苗的设计奠定了基础.

重组人Ⅱ型胶原蛋白免疫原性多肽表达的研究

目的构建编码人Ⅱ型胶原蛋白250～270多肽片段(HuC Ⅱ 250～270)的多聚基因,以获得高效表达、高度可溶和便于纯化的重组多肽基因.方法选用大肠杆菌(E.coli)偏爱密码子优化HuC Ⅱ 250～270的基因组成.通过化学合成和PCR法,获得HuC Ⅱ 250～270的基因,并利用Bam HI和BglⅡ同裂酶进行酶切位点串联获得6聚体.对影响重组HuC Ⅱ 250～270表达的各种因素进行系统研究,以获得优化表达的条件.对表达产物进行分离纯化.结果酶切分析和DNA测序证实,6聚目的基因的构建正确.融合表达的量明显高于非融合表达,在优化条件下,可达30%.表达产物的可溶性明显提高(在90%以上),其相对分子质量(Mr)与预期的相符,纯化后的纯度达90%以上.结论实现了HuC Ⅱ 250～270的高效表达,为研究类风湿性关节炎的发病机制和治疗提供了实验依据.为在原核细胞中高效表达的胶原蛋白的功能性小片段,提供了可供参考的借鉴.

兔抗大鼠神经甾体合成关键酶P450scc抗体的制备、特性鉴定及应用

目的: 制备兔抗大鼠神经甾体合成关键酶P450侧链裂解酶(rP450side chain cleavage,rP450scc)合成肽片段的抗体, 并检测rP450scc在大鼠脑组织及神经细胞中的表达.方法: 利用多肽固相合成法(Fmoc法)合成对称的8分支16肽rP450scc多重抗原肽片段(rP450scc-16), 并以其免疫雄性新西兰兔制备抗rP450scc-16抗体.采用ELISA、 Western blot和免疫细胞化学染色法鉴定抗rP450scc-16抗体的特性.结果: 于末次免疫后5 d, 动脉放血分离血清, 用ELISA法检测抗rP450scc-16抗体的效价为1∶ 6 400.Western blot检测显示, 抗rP450scc-16抗血清与大鼠的脑、睾丸及肾上腺组织蛋白于相对分子质量为50 000处出现一条特异性的条带.用抗rP450scc-16抗体进行免疫细胞化学染色显示, 在正常大鼠的下丘脑、皮质、 海马等区及培养的胶质细胞胞质中均可见棕色颗粒.结论: 制备出高特异性的兔抗rP450scc-16抗体, 该抗体可检测rP450scc在正常大鼠脑组织中的表达和分布.

多肽转移电泳时间探讨

转移电泳是将凝胶电泳分离的结果, 通过电泳装置转移到固相支持物(如硝酸纤维素膜)上的一种电泳技术, 可用于DNA片断的分析(Southern blot)、RNA的分析(Northern blot)和蛋白质的研究(Western blot).由于转移到固相支持物上的样品可进行多种分析, 且操作简便、灵敏度高和特异性强, 目前广泛应用于生物化学、分子生物学和免疫学等研究领域.

Tris-SDS-PAGE测定多肽的相对分子质量

蔗糖-SDS-PAGE测定多肽的相对分子质量

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是测定蛋白质相对分子质量(Mr)常用的方法，尤其在低Mr蛋白质(10 000～100 000)测定中得到广泛应用；而对小分子多肽Mr的测定目前主要采用甘油SDS-PAGE法〔1,2〕和脲SDS-PAGE法〔3〕。这些方法操作繁琐、结果也不够理想。我们在多次实验的基础上，建立了用蔗糖-SDS-PAGE两层胶系统测定多肽(Mr为2 500～17 000)的新方法。

人类Ⅱ型胶原蛋白活性肽段多聚基因的构建和表达

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的发展机理尚未完全阐明,目前认为与自身免疫密切相关,Ⅱ型胶愿蛋白(type Ⅱ collagen,CⅡ)是可能的自身抗原(1).国外的研究提示,CⅡ的这种免疫活性主要一现在其250-270片段(hCⅡ250-270)上[1,2].本文用基因工程的方法,选用大肠杆菌(E.coli)偏爱密码子,化学合成优化该片段的基因组成,利用酶切位点将其串联成六聚体,并在E.coli中进行表达,获得大量重组hCⅡ250-270的类似物,为进一步研究该段活性肽的功能提供条件.

抗 HPV18 E6多肽单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备特异性抗人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）18 E6多肽抗体。方法通过在线分析软件AB-Cpred和Bcepred预测 HPV 18E6特异性多肽序列，将多肽序列与牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）偶联，以偶联后多肽为抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗 HPV18 E6多肽单克隆抗体；以 HPV18阳性分泌物标本DNA为模板，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）获得 HPV 18 E6基因，将该基因插入表达质粒 pET-28a，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的蛋白表达；采用 Western Blot方法鉴定抗 HPV18 E6多肽抗体与目的蛋白的反应性。结果建立的杂交瘤细胞株能稳定产生 HPV18 E6多肽单克隆抗体；重组表达质粒 pET-28a-HPV18 E6测序证明构建正确，成功表达 HPV18 E6蛋白；纯化后的抗 HPV 18 E6多肽抗体可特异性识别原核表达 HPV 18 E6蛋白。结论成功制备抗 HPV18 E6多肽序列，该抗体具有较好的特异性。

细胞因子在抗病毒免疫中作用的研究进展

细胞因子是多种细胞所分泌的能调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合等小分子多肽的统称.近十余年来,细胞因子发展迅猛,现已发现几十种细胞因子,并形成研究细胞因子的专门学说-细胞因子学.细胞因子是一类可诱导的多肽,通过作用于细胞因子受体(cytokine receptor),引发靶细胞内一系列连锁反应而发挥作用.近的研究发现,微生物,尤其是病毒,可能通过分子模拟(molecularmimicry)利用细胞因子系统、扰乱免疫系统而攻击宿主.因此深入研究细胞因子受体和微生物蛋白之间的关系可为疾病的预防开辟新的途径.

促红细胞生成素衍生肽抑制细胞自噬减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤

目的 探讨促红细胞生成素衍生肽即螺旋B表面肽(helix B surface peptide,HBSP)对缺血/再灌注(I/R)诱导小鼠心肌细胞损伤的保护作用及其机制.方法 将56只雄性昆明小鼠随机分成4组:假手术(Sham)组、I/R组、I/R+HBSP组、I/R+HBSP+Wortmannin(I/R+HBSP+Wort)组.将原代心肌细胞随机分成4组:空白对照(Control)组、缺氧/复氧(H/R)组、H/R+HBSP组、H/R+HBSP+Wortmannin(H/R+HBSP+Wort)组.分别使用超声检测系统测定左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS);双染法测定心肌梗死面积,Western blot检测蛋白表达及磷酸化水平,电镜观察细胞自噬小体及线粒体,共聚焦显微镜观察LC3(细胞自噬强度常用指标)数量.结果 与I/R组比较,I/R+HBSP组LVEF、左室FS增高(P＜0.05),心肌梗死面积缩小(P＜0.05),心肌细胞自噬小体数量减少.与I/R+HBSP组比较,I/R+HBSP+Wort组LVEF、左室FS下降(P＜0.05),心肌梗死面积增加(P＜0.05),心肌细胞自噬小体数量增加.与H/R组比较,H/R+HBSP组中p-Akt、p-mTOR及P62表达升高(P＜0.05),LC3-II/LC3-I比值下降(P＜0.05),LC3数量减少(P＜0.05).与H/R+HBSP组比较,H/R+HBSP+Wort组中p-Akt、p-mTOR及P62表达下降(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-I比值升高(P＜0.05),LC3数量增加(P＜0.05).结论 促红细胞生成素衍生肽能显著抑制细胞自噬减轻小鼠心肌I/R损伤,其保护效应可能与激活PI3 K/Akt/mTOR转导通路相关.

促红细胞生成素衍生肽抑制缺血/再灌注损伤诱导的大鼠心肌细胞凋亡

目的:探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)衍生肽又称螺旋B表面肽(helix B surface peptide,HBSP)在大鼠心肌缺血/再灌注损伤(I/RI)中的拮抗作用及其机制.方法:82只200～250 g雄性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组(n=18)、缺血/再灌注(L/R)组(n=18)、EPO组(n=18)、HBSP组(n=18)及HBSP+ LY294002(PI3k特异性抑制剂)组(n=10).于灌注前5 min,于EPO组及HBSP组大鼠的尾静脉分别注射生理盐水重组人EPO(rhEPO;3 000 U/kg,4 ml/kg)及生理盐水HBSP(60μg/kg,4 ml/kg).颈动脉插管检测血流动力学指标,采用小动物超声分别检测24 h、l周后大鼠心功能.用rTTC-EB双染测定梗死面积,Western blot法检测心肌组织蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt的表达.用TUNEL法检测心肌细胞凋亡.结果:与I/R组相比,EPO组和HBSP组再灌注后大鼠心脏左室收缩压(LVSP)、左室内压大上升速率(+dp/dtmax)以及大下降速率(-dp/dtmax)明显改善(P＜0.05),左室射血分数[LVEF(％)]、室间隔厚度(IVSS)及左室短轴缩短率[FS(％)]显著增加(P＜0.05),同时心肌梗死面积明显缩小(P＜0.05),心肌细胞凋亡显著减少(P＜0.05);HBSP组Akt磷酸化水平显著提高(P＜0.05).HBSP+ LY294002组与HBSP组相比,Akt磷酸化水平明显降低,心肌细胞凋亡指数显著增高(P＜0.05).HBSP组与EPO组间各项指标均无显著差别.结论:HBSP能够显著抑制I/RI诱导的大鼠心肌细胞凋亡,减少梗死面积,明显改善心功能,其保护作用可能与激活PI3K-Akt通路有关.

核酸多肽,健康美容

PNRC多肽通过干扰核受体途径抑制BT474细胞的增殖

目的:运用核受体辅活化子PNRC的抗Ras PTD融合多肽(PTD-PARP)研究其在乳腺癌细胞BT474中的分布、对核受体信号传导途径的影响及其抗肿瘤细胞增殖活性.方法:用多肽合成仪合成PTD-PARP、单独的PARP和PTD多肽以及FTFC标记的PTD-PARP、PARP.HPLC分析和纯化后,荧光显微镜结合流式细胞仪检测PTD-PARP、PARP在BT474细胞中的分布.虫荧光素酶报告基因检测PTD-PARP对野生型PNRC辅活化ER反式激活功能的影响.MTS、软琼脂克隆形成实验检测PTD-PARP对BT474细胞的抗增殖活性.结果:PTD-PARP能进入BT474细胞,抑制野生型PNRC辅活化ER的反式激活功能并抑制BT474细胞的增殖.结论:PNRC抗RasP DT融合多肽可通过干扰核受体途径抑制乳腺癌细胞的增殖.

淋病奈瑟菌膜蛋白抗原表位的研究

目的 利用人工合成多肽制备针对淋球菌外膜蛋白PIB抗原表位的特异性多克隆抗体,以期用于淋球菌的检测,为进一步建立新型淋病快速诊断方法提供研究基础.方法 根据PIB抗原表位的氨基酸序列合成一段多肽(LD1),并将其与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联构成完全抗原LD1-KLH,免疫动物,收集抗血清,用ELISA和Western blot检测其特异性.结果 ELISA检测表明,LD1-KLH具有免疫原性,免疫动物能刺激机体产生较强的体液免疫反应,兔血清抗体和豚鼠血清抗体效价高分别达到1∶3 200和1∶25 600;抗血清能与淋球菌临床株特异性结合,与葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌和真菌等其他微生物之间没有交叉反应;Western blot结果显示,抗血清能识别淋球菌裂解物,产生特异性条带,相对分子质量(Mr)为37 300.结论 人工合成多肽具有免疫原性,能诱导机体产生识别淋球菌抗原表位的特异性抗体.

人工合成mutacin的抑菌活性研究

目的:研究人工合成mutacin Ⅰ和Ⅲ对牙菌斑主要致龋菌的抑制作用,寻找其活性基团.方法:通过固相合成法合成mutacin Ⅰ和Ⅲ及不同链长的系列短肽.采用二倍稀释法检测系列短肽对变形链球菌和血链球菌的小抑菌浓度,并检测其对变形链球菌、血链球菌、韦荣氏菌、黏性放线菌、内氏放线菌、远缘链球菌的抑菌圈直径大小.结果:人工合成mutacin Ⅰ和Ⅲ及部分短肽类似物对变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌有抑菌活性.结论:人工合成的mutacin Ⅰ和Ⅲ及部分短肽类似物有一定的抑菌活性,可初步确定其活性基团位置.

牙髓损伤性刺激诱导大鼠三叉神经脊束尾侧亚核内P物质等多肽的表达