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β2GPI/抗 β2GPI抗体复合物激活THP-1细胞内TRIF途径
目的:观察β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能否激活单核细胞株THP-1的TRIF途径,以探讨TRIF依赖途径在抗磷脂综合征(APS)发病机制中的作用.方法:采用一定剂量β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA及总蛋白,荧光定量PCR (RT-PCR)检测细胞TRIF mRNA水平,Western blot检测细胞TRIF蛋白表达情况；进一步观察TLR4途径抑制剂-TAK-242是否干预β2GPI/抗β2 GPI抗体复合物对TRIF的诱导表达以及相关细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的表达.结果:β2GPI/抗β2 GPI抗体复合物( 100 mg/L)能够诱导THP-1细胞表达TRIF(mRNA 及蛋白),并显示时间效应,分别于刺激1h和2h时TRIF mRNA及蛋白表达至高峰.TAK-242(5μmol/L)能够明显抑制β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对THP-1细胞TRIF的诱导表达,同时抑制IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达.结论:TRIF依赖的TLR4途径参与了β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对THP-1细胞的激活,提示其在抗磷脂综合征的病理机制中发挥一定作用.
关键词： 抗磷脂综合征 β2 GPI/抗β2GPI抗体 TLR4 TRIF 炎症因子 -
实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节
目的: 建立检测小鼠Toll样受体4(TLR4)mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; 观察小鼠骨髓源树突状细胞(DC)发育成熟过程中TLR4 mRNA表达水平的动态变化以及地塞米松(DEX)对DC TLR4 mRNA表达的影响.方法: (1)用细胞因子定向诱导的方法将小鼠骨髓细胞培养为DC; (2)构建pUCm-T/TLR4和pUCm-T/β-actin重组质粒, 建立检测小鼠TLR4 mRNA水平的实时定量PCR实验; (3)用实时定量PCR技术对体外培养4、 6、 8、 10、 12 d的DC TLR4 mRNA表达水平进行动态观察; (4)在DC培养体系中加入DEX, 与常规培养DC TLR4 mRNA表达水平进行比较.结果: (1)从小鼠骨髓细胞中成功诱导培养了DC, 经免疫磁珠纯化后其纯度可达90%以上; (2)建立了能精确分析小鼠TLR4 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; (3)在DC培养前期TLR4 mRNA表达水平变化不大, 后期则明显升高; (4)DEX可使DC TLR4 mRNA表达增强.结论: 小鼠骨髓源DC TLR4 mRNA表达水平与其发育成熟阶段密切相关; DEX促进DC TLR4 mRNA表达.
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血管紧张素Ⅱ诱导RAW264.7细胞Toll样受体4表达及髓过氧化物酶活性的机制研究
目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对RAW264.7细胞Toll样受体4(TLR4)mRNA、蛋白表达及髓过氧化物酶(MPO)活性的影响及其致炎致动脉粥样硬化(AS)机制.方法:体外培养RAW264.7细胞, 用不同浓度的AngⅡ(1、 10、 100、 1000 nmol/L)及100 μg/L脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞24 h后, RT-PCR法测RAW264.7细胞TLR4 mRNA水平, Western blot检测RAW264.7细胞TLR4蛋白表达, 比色法测细胞培养上清中MPO活性.同时, 预先加入不同剂量的TLR4阻断剂(1 mg/L、 5 mg/L)后, 再用AngⅡ(100 nmol/L)刺激RAW264.7细胞24 h, 检测细胞培养上清中MPO活性.结果:AngⅡ浓度依赖性地增加RAW264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白表达(P<0.01), LPS也可诱导RAW264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白表达(P<0.01); AngⅡ浓度依赖性地升高RAW264.7细胞MPO活性(P<0.01), LPS也可升高RAW264.7细胞MPO活性(P<0.01), 而TLR4阻断剂明显抑制AngⅡ这一效应(P<0.01).结论:AngⅡ上调RAW264.7细胞TLR4表达, 通过跨膜受体TLR4诱导MPO分泌, 加重炎症反应, 促进AS的形成和发展.
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严重烧伤大鼠脾脏Toll样受体4表达及其与CD4+ CD25+调节性T细胞的关系
目的: 观察严重烧伤早期大鼠脾脏Toll样受体4(TLR4)、TNF-α mRNA的表达变化及外周血CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)和内毒素(ET)的变化规律, 探讨烧伤后肠源性感染时机体的防御反应机制.方法: 将大鼠随机分成正常对照组和烧伤组, 在其背部造成30%体表面积Ⅲ度烧伤模型, 在烧伤前及烧伤后2、5、8、12、24、48及72 h等不同时间点留取脾脏组织和外周血, RT-PCR方法测脾脏TLR4、TNF-α mRNA表达, Western blot法测脾脏TLR4蛋白表达, 流式细胞术检测血浆Treg百分数, 鲎试剂法测血浆内毒素含量.结果: 各观测指标值较伤前显著升高, TLR4 mRNA、TLR4蛋白、Treg和ET均在烧伤后8 h达高峰, 其峰值分别为3.66±0.51、2.27±0.19、(63.19±12.65)%和11.68±1.71 Eu/mL; TNF-α表达高峰在烧伤后12 h, 峰值为1.65±0.23; 各观测指标峰值与正常对照组比较, 差异有统计学意义(P＜0.01).烧伤后TLR4 mRNA的表达与Treg、ET及TNF-α mRNA之间均呈正相关, 相关系数分别为0.898、0.811和0.462(P＜0.01).结论: Treg在严重烧伤早期的免疫调节过程中发挥了重要作用, 其机制与烧伤后肠源性内毒素上调的LPS-TLR4信号转导系统有关.
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Toll样受体4和巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞生物活性的影响
目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对ECV304内皮细胞增殖、黏附及炎症因子水平的影响.方法:ECV304细胞经TLR4 MIF单克隆抗体(mAb)和脂多糖(LPS)处理后,通过~3H-TdR掺入实验、黏附实验和放射免疫分析研究细胞增殖、黏附和细胞因子水平.结果:LPS(10 mg/L)明显促进ECV304细胞TLR4的表达,而抗MIF mAb(10、50 mg/L)明显抑制其表达.抗MIF(50 mg/L)和抗TLR4mAb(1 mg/L)明显抑制了ECV304细胞的增殖,而LPS(10 mg/L)明显促进增殖.抗MIF mAb明显抑制了人外周血淋巴细胞对ECV304细胞的黏附,而LPS和抗TLR4 mAb对黏附无显著影响.抗MIF、抗TLR4 mAb明显抑制ECV304细胞TNFα的分泌,并呈剂量依赖,而LPS作用相反.与对照组相比,LPS(1 mg/L,48 h)可以促进ECV304细胞IL-8的分泌,抗MIF mAb(50 mg/L,48 h)可以明显抑制IL-8的分泌(P＜0.05).但是抗TLR4 mAb(1 mg/L)对ECV304细胞IL-8的分泌无明显影响.结论:LPS、抗TLR4及抗MIF mAb对血管内皮细胞TLR4表达及活性有显著影响.
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辛伐他汀对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的拮抗作用及其作用机制
目的:探讨辛伐他汀对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的拮抗作用及潜在机制.方法:分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠(乳鼠)心肌细胞,随机分为对照组、缺氧2h/复氧4 h(H/R4h)组、不同浓度(0.1、1.0及10 μmol/L)的辛伐他汀干预组及Toll样受体4(TLR4)中和性抗体MTS510组(浓度为10μg/L).H/R4h组给予缺氧2 h后,随即复氧4 h.细胞处理后,进行PI-Annexin V染色用流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡率,用ELISA法检测心肌乳酸脱氢酶(LDH)的活性;用免疫印迹法测TLR4蛋白的含量.结果:与H/R4h组相比,辛伐他汀干预组可显著降低心肌细胞的凋亡率(16.0%vs.28.6%,P<0.01)及LDH的活性(P<0.01),并呈剂量依赖性.中浓度的辛伐他汀组开始出现拮抗作用,峰值出现在高浓度辛伐他汀组,加入MTS510阻断剂可降低心肌细胞的凋亡率及LDH的活性(P<0.01).结论:辛伐他汀对H/R造成的心肌细胞损伤具有拮抗作用,并呈剂量依赖性,其作用机制可能与TLR4信号通路有关.
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TLR4信号通路与动脉粥样硬化的研究进展
近年来,研究TLR4信号通路在动脉粥样硬化(AS)中的作用成为心血管领域中的一个热点.本文就TLR4的结构、功能、信号转导机制及其与AS之间关系的体内、体外试验依据和基因学依据作一综述.
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TLR4基因多态性对肝癌细胞HepG2增殖、迁移及凋亡的影响
目的:研究TLR4基因多态性对人肝癌细胞HepG2细胞增殖、迁移及凋亡的影响,并探讨其相关分子机制.方法:构建TLR4野生型(WT)、1196(C/T)位点及896(A/G)位点突变型质粒并将其稳转HepG2细胞株中;CCK-8法检测、Annexin V-PE/7-AAD流式细胞仪及Transwell小室实验检测TLR4基因多态性对HepG2细胞增殖、迁移及凋亡的影响;Western blot检测NF-κB p65(nuclear factorκB p65)表达水平的差异.结果:Western blot结果表明三组TLR4过表达细胞株中TLR4的含量显著高于正常组.与正常HepG2细胞相比,三组TLR4过表达细胞株增殖能力、迁移能力及p65表达量均增加;与TLR4野生型组相比,两组突变型细胞株增殖能力、迁移能力及p65表达量均减弱,且凋亡率增加,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:TLR4可能通过影响NF-κB p65相关蛋白的表达促进肝癌细胞HepG2的增殖及迁移,其基因1196(C/T)位点及896(A/G)位点的突变会减弱肝癌细胞的增殖及迁移能力.
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亚低温治疗对脑出血大鼠TLR4/NF-κB介导的神经炎症反应的影响
目的:研究亚低温治疗对脑出血后大鼠Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)介导的神经炎症反应的影响.方法:60只成年SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、脑出血模型组(ICH组)和亚低温治疗组(n=20).采用自体血注入法复制大鼠脑出血模型,并给予亚低温干预.应用Berdson评分标准对各组大鼠进行神经功能评分,放射免疫法检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)的含量;免疫组织化学法及免疫印迹法检测TLR4、NF-κB的蛋白表达情况.结果:与Sham组比,模型组大鼠神经功能评分明显增加(P＜0.05),TNF-α和IL-1β的含量明显升高(P＜0.05),血肿周围脑组织TLR4和NF-κB的表达显著上调(P＜0.05).与模型组相比,亚低温治疗组大鼠神经功能评分显著减少(P＜0.05),TNF-α和IL-1β的含量明显降低(P＜0.05),TLR4和NF-κB蛋白的表达量显著下调(P＜0.05).结论:亚低温治疗能通过调控TLR4/NF-κB表达,减轻大鼠脑出血后血肿周围脑组织的炎症反应,具有一定的神经保护作用.
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成年大鼠视神经夹伤后TLR4与GAP-43表达时程的比较
目的:明确视神经损伤引起的固有免疫应答反应与视网膜神经节细胞轴突再生之间的时间关系.方法:将成年SD大鼠随机分为视神经损伤组与假手术对照组,损伤组动物左侧视神经以钳夹法损伤,对照组仅暴露左侧视神经.手术第1、3、7d处死后取左侧视神经干,用Western Blot方法检测视神经干toll样受体4(toll-likereceptor4,TLR4)和生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43,GAP-43)蛋白表达水平.结果:视神经干内TLR4和GAP-43蛋白在损伤后第1d都趋于表达上调,但其后的变化趋势具有不同的时间特征,即TLR4持续上调,并在损伤后7～14 d内维持呈平台;而GAP-43的表达在损伤后第7d呈峰值,其后逐渐下降,第14 d基本恢复至基线水平.结论:TLR4介导的固有免疫应答有可能影响视神经再生;TLR4和GAP-43表达变化的不同为进一步研究固有免疫应答对视神经再生的影响提供了有益的线索.
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辛伐他汀对大鼠脑出血后TLR4介导的炎症损伤的干预作用
目的:探讨辛伐他汀(simvastatin,SIM)对大鼠脑出血后Toll样受体4(toll-like receptor4,TLR4)介导的脑内炎症损伤的干预作用.方法:采用注入自体血方法复制脑出血(intralerebral hemorrhage,ICH)模型,随机分为假手术组、模型组和干预组.Garcia等方法进行神经功能障碍评分；干湿重法检测脑组织含水量；免疫组化SP法检测TLR4和IL-1β蛋白的表达；免疫印迹检测TLR4和IL-1β蛋白的表达水平.结果:与假手术组比较,ICH模型组脑组织含水量明显升高(P＜0.05),TLR4和IL-1β蛋白的表达明显增加(P＜0.05)；辛伐他汀干预后,TLR4表达量下降,IL-1β蛋白的表达及脑含水量明显下调,与脑神经功能障碍评分上调相一致.结论:大鼠脑出血后引起出血周围脑组织炎症损伤,辛伐他汀可能通过减轻TLR4介导的炎症损伤,改善神经功能恢复,起到神经保护作用.
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TLR4与TNF-а在脑缺血再灌注小鼠海马CA1区神经元中的表达
目的:探讨Toll样受体4(TLR4)在脑缺血再灌注损伤炎症反应中的作用.方法:采用抗TLR4抗体封闭阻断TLR4,应用HE染色观察小鼠海马CA1区组织病理学改变、Western Blot和RT-PCR检测海马TLR4蛋白和mRNA表达量,免疫组化方法检查TNF-а表达.小鼠随机分为3组,即假手术组(S组)、缺血再灌注组(I组)和TLR4阻断组(T组),各组又分12,24,48和72 h 4个时间点组.结果:缺血再灌注组TLR4蛋白、TLR4 mRNA和TNF-а表达水平明显高于假手术组表达水平(P<0.05),而TLR4阻断组TLR4蛋白、TLR4 mRNA和TNF-а表达水平明显少于缺血再灌注组(P<0.05).相关分析表明,TLR4mRNA表达水平与TNF-а含量呈显著正相关(P<0.01).结论:本结果提示缺血再灌注可激活TLR4,TLR4在脑缺血再灌注损伤中起重要作用;炎性因子TNF-а的产生、分泌可能与TLR4mRNA表达存在密切联系.
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HMGB1在癫痫发病机制中的作用研究进展
癫痫是常见的一类脑部疾病,全球大约有6000万患者,其中约有30％癫痫患者对抗癫痫药物治疗无效[1],发展为药物难治性癫痫,需要外科手术干预.目前,大量研究证据提示,神经系统免疫炎症反应可能与癫痫的发生发展密切相关[2].高迁移率族蛋白(high mobility group protein,HMG)是一种核内结构蛋白,真核细胞中含量丰富,具有修饰、弯曲、改变DNA结构的功能.HMG主要包括3个家族成员,即HMGA、HMGB以及HMGN[3].其中HMGB家族包括3个成员,即HMGB1、HMGB2、HMGB3 (HMG4/HMG2b),它们在氨基酸序列上有着80％的同源性[3].大量研究显示,HMGB1作为一种促炎症细胞因子,其不同存在形式具有不同的生物学功能.
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曲霉菌预处理前后大鼠角膜上皮TLR4受体的表达
目的 检测曲霉菌预处理前后大鼠角膜上皮TLR4受体的表达变化.方法 健康Wistar大鼠24只随机分为A、B、C、D共4组,A组不予特殊处理,B、C、D三组以罩杯法刺激大鼠角膜4h建立曲霉菌刺激模型.B组在完成刺激后立即取角膜上皮,C组在96h后取角膜上皮,D组在96h后重复刺激,其后取角膜上皮,采用Real-time PCR法检测所取上皮组织中TLR4受体mRNA的表达.结果 罩杯法建立大鼠角膜曲霉菌刺激模型后TLR4受体mRNA的表达明显上升,但96h后已趋于正常,再次刺激后受体mRNA的表达变化与初次刺激差异无统计学意义(P>0.05).结论:罩杯刺激法可以使TLR4受体mRNA表达上升,但受体并未因曲霉菌刺激而产生基础表达量的变化,重复刺激后受体表达亦无明显差异.
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白藜芦醇减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤并抑制TLR4/NF-κB活化
目的:探究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜细胞(hPDLCs)损伤的保护作用.方法:体外培养并鉴定hPDLCs,将培养的hPDLCs随机分为5组:对照组、LPS(10 μg/ml)+RES(0、30、60、90tμmol/L)组,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测各组细胞分泌TNF-α/IL-6水平,PCR和Western blot检测各组细胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达.结果:分离培养的hPDLCs抗波丝蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性.与对照组比,LPS处理后细胞增殖能力明显降低,细胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达明显增加;30～90 μmol/L白藜芦醇预处理后,细胞增殖能力增加(P＜0.05),细胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表达则下调(P＜0.05),均呈现一定的浓度依赖性.结论:白藜芦醇可抑制TLR4/NF-κB活化并减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤.
关键词： 白藜芦醇 LPS 人牙周膜细胞(hPDLCs) TLR4 NF-κB -
CD14、TLR4在大鼠尖周炎症组织中的表达
目的:探讨CD14、TLR4在尖周组织中的分布和表达,为阐明CD14、TLR4在LPS引起的炎症反应中的作用机制提供实验依据.方法:分别将Pe、Pg菌液封入大鼠髓腔建立大鼠尖周炎症模型,并以髓腔自然开放和开髓后无菌坏死作为对照.免疫组织化学染色观察CD14、TLR4在尖周组织的分布情况.结果:4组的尖周炎症组织中均可见大量CD14、TLR4表达阳性细胞,以单核巨噬细胞为主.结论:LPS信号受体CD14和TLR4 可能参与大鼠LPS介导的尖周炎症反应.
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miR-146a在人炎症牙周膜干细胞中的表达及其与TLR4靶向调控作用的研究
目的:检测miR-146a在人健康及脂多糖(LPS)刺激炎症牙周膜干细胞(PDLSCs)后的表达情况,并探讨其与TLR4的作用关系.方法:分别提取牙周健康者和牙周炎患者的PDLSCs,通过Real-Time PCR检测人健康及LPS刺激后炎症PDLSCs中miR-146a 的mRNA表达水平;Real-Time PCR、Western blot及荧光素酶报告基因检测miR-146a与TLR4的相互作用关系.结果:炎症PDLSCs中miR-146a的mRNA表达水平明显高于健康组(P <0. 05);LPS 刺激的炎症 PDLSCs 中 miR-146a 的 mRNA 表达水平显著增高(P<0.05).与空白组相比,过表达miR-146a后,TLR4 mRNA及蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);抑制miR-146a的表达后,TLR4 mRNA及蛋白的表达水平均显著增加(P<0.05);荧光素酶报告基因检测结果显示, miR-146a与TLR4的3′UTR具有靶向抑制作用.结论:miR-146a在人炎症PDLSCs中表达上调,同时可显著下调其靶基因TLR4的表达,推测miR-146a可能参与了DPLSCs的炎症反应调控.
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变应性鼻炎患者血液嗜酸性粒细胞富集群中TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的变化及其相关性
目的 探讨变应性鼻炎(AR)患者血液嗜酸性粒细胞富集群中 TLR2、TLR4、TLR7 和 TLR9 的变化及其相关性,探索其在 AR中的发病机制.方法 收集健康人和 AR患者的外周静脉血,用蒿草花粉、尘螨和梧桐花粉过敏原提取液刺激,流式细胞术检测刺激前后嗜酸性粒细胞富集群中 TLR2、TLR4、TLR7 和 TLR9 的表达,SPSS软件分析TLR2+、TLR4+、TLR7+和TLR9+嗜酸性粒细胞的相关性.结果 与健康组比较,AR 患者未经过敏原刺激时嗜酸性粒细胞富集群中TLR2+细胞的比例降低4%,TLR4+细胞的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)升高20%,TLR7+细胞的比例升高4.8 倍.蒿草花粉过敏原提取液诱导AR患者TLR2+嗜酸性粒细胞的比例升高7.8%.此外,AR患者血液 TLR2+和 TLR4+、TLR2+和 TLR7+、TLR7+和 TLR9+的嗜酸性粒细胞均呈中度相关(Pearson相关系数分别为r=-0.670,P＜0.01;r=-0.430,P＜0.05;r=0.446,P＜0.05).而健康人嗜酸性粒细胞富集群中TLR2、TLR4、TLR7 和TLR9 的变化在过敏原刺激前后差异均无统计学意义.结论 嗜酸性粒细胞源的 TLR2、TLR4 和TLR7 可能在 AR中起重要作用,TLR2 、TLR4 和TLR7 可能是治疗 AR的潜在靶点.
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TLR4抗体对Aβ1-42诱导AD小鼠模型神经功能作用
目的探讨TLR4抗体对Aβ1-42诱导阿尔茨海默病小鼠模型学习记忆功能的影响。方法采用双侧海马注射Aβ1-42的方法制备小鼠AD模型,以C57BL/6小鼠为实验对象,随机分为四组,AD组,抑制剂组,AD+抑制剂组,生理盐水组,水迷宫实验观测小鼠行为学改变。结果 AD组模型与生理盐水组比较,其潜伏期延长,穿越平台次数减少,游泳距离、内环时间及内环距离延长,游泳速度减慢。AD+抑制剂组与AD组比较,其潜伏期缩短,穿越平台次数相对增多,游泳距离、内环时间及内环距离缩短。生理盐水组及抑制剂组属于对照组,这两组之间无显著差异。结论给予TLR4抗体可以改善AD小鼠的学习记忆功能。
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TLR2和TLR4与慢性心功能不全患者免疫球蛋白的相关性研究
目的对72例慢性心功能不全患者进行外周血单核细胞Tol 样受体2和4的表达变化与患者体内免疫球蛋白指标变化的相关性研究并将所研究的结果外推至人群性的疾病研究。方法选取我院的心内科接受治疗的72例心功能不全患者进行回顾性的资料分析，同时选取35名健康人作为对照组。使用流式细胞技术和德国BN-Ⅱ全自动特种蛋白分析仪检查TLR2、TLR4及免疫球蛋白相关指标，探究其相关性。结果 TLR4阳性在外周血单核细胞中表达轻微组和严重组较对照组相比差异显著(P<0.05)，TLR2阳性在外周血单核细胞中的表达与IgA和IgG具有正相关(P<0.05)，TLR4阳性在外周血单核细胞中的表达与IgA具有正相关(<0.05)。结论TLR2和TLR4与慢性心功能不全患者免疫球蛋白具有相关性。
