首页 > 文献资料
-
TLR4基因3'非翻译区11367位点多态性与婴幼儿喘息性疾病的研究
目的 检测TLR4基因3'非翻译区(3'UTR)11367位点的多态性,探讨该多态性与喘息性疾病的易感性、气道分泌物的细胞因子水平、病原学以及临床表型的关系.方法 采用单管双向等位基因特异性扩增技术检测TLR4基因3'UTR 11367位点的基因多态性.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测喘息组患儿气道分泌物中细胞因子的水平.采用免疫荧光法进行呼吸道合胞病毒检测.结果 TLR4G11367C位点核苷酸存在G/C二态性,表现为GG纯合、GC杂合两种基因型.喘息组和对照组该位点基因型、等位基因分布频率之间均存在显著性差异(P均为0.002).GG型患儿IL-8水平、病原菌感染阳性率均明显高于GC型.不同基因型的临床表型无显著性差异.结论 TLR4基因3'UTR基因多态性与喘息性疾病易感性相关,且与气道分泌物中IL-8水平、机体对RSV易感性、气道细菌定植有关.
-
TLR4介导HSP70BCG诱导的小鼠骨髓树突状细胞分泌IL-12
目的 观察TLR4(Toll-like receptor 4)在卡介苗来源的热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70BCG)冲激的小鼠骨髓来源树突状细胞(dendritic cells,DCs)的IL-12分泌的作用.方法 用rmGM-CSF和rmIL-4诱导小鼠骨髓来源的DCs,在HSP70BCG冲激前加入抗TLR4抗体,用流式细胞仪检测DCs的CD40和CD86表达;用ELISA法检测DCs上清液中的IL-12和脾T细胞上清液中的IL-2浓度.结果 抗TLR4抗体对CD40和CD86的表达无明显影响,但明显抑制DCs分泌IL-12并进而抑制DCs致敏的脾细胞分泌IL-2.结论 HSP70BCG可通过TLR4途径诱导DCs分泌IL-12.
-
TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定
目的构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体,并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达.方法利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段,约1 800 bp,然后将其克隆入pMD18-T载体中.测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中,并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达.结果 PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致.重组质粒经酶切鉴定及测序证实,TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HB101后用IPTG诱导,获得Mr 92 000的GST-TLR4融合蛋白;37 ℃,0.2 mmol/L IPTG诱导4 h,SDS-PAGE电泳后,经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34.25%,部分以包涵体存在,可溶性蛋白约占27.84%;亲和层析纯化后纯度大于90%.Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合.结论成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4,并在大肠杆菌中获得有效表达,获得了纯度大于90%的可溶性GST-TLR4融合蛋白,为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础.
-
TLR4胞内区的同源模建
目的为进一步研究新发现的TLR4蛋白在LPS对机体细胞产生作用的机制,分析其Q结构上的功能区域.方法同源模建,通过计算机模拟从理论上对TLR4胞内区的功能区域进行探讨.结果 Pro712His突变体溶液可及表面的亲疏水性质有明显变化, 且相应位置所带的电荷从中性变为正电荷.结论 TLR4胞内区在发生作用时,起主要作用的是疏水性作用,下一个接头蛋白MyD88与TLR4胞内区相互作用的部位应当是一个有较强疏水作用的区域.这样当Pro712His突变体出现时,由于电荷的排斥,疏水作用无法达到点突变以前的强度,2个蛋白的结合不能得以实现,信号无法继续传递.从而出现对LPS的耐受现象.
-
竹节参醇提物免疫佐剂作用的实验研究
目的 采用高效液相色谱法(HPLC)筛选竹节参醇提物中佳免疫佐剂活性部位,进而探讨此有效部位作为HBsAg佐剂的作用及可能机制.方法 通过HPLC初步分离和分析竹节参醇提物,MTT法检测不同浓度乙醇洗脱的竹节参皂苷中佳佐剂活性部位,将此部位与HBsAg共同注入到雌性Balb/c小鼠体内进行免疫,小鼠随机分为正常对照组,HBsAg模型组和(HBsAg+竹节参醇提物)低(300μg)、高剂量(600μ g)组,末次免疫7d后收集小鼠淋巴细胞并采集血清,CCK-8检测脾淋巴细胞增殖情况;间接ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度;RT-PCR法检测脾淋巴细胞中相关细胞因子的表达;流式细胞仪检测细胞表面蛋白的表达.结果 竹节参醇提物显著促进淋巴细胞的增殖,60％浓度的醇过大孔树脂所得竹节参皂苷对淋巴细胞的增殖显著(P＜0.01);显著增强小鼠血清中抗HBsAg的IgG、IgG1和IgG2b亚型抗体滴度;上调细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10的表达;增强TLR4受体的表达.结论 竹节参醇提物中60％乙醇提取物具有较强的免疫佐剂作用,作为HBsAg抗原佐剂是通过活化TLR4受体来发挥作用的.
-
低剂量阿奇霉素对铜绿假单胞菌引起小鼠肺部感染的抗炎机制
目的 分析阿奇霉素对感染铜绿假单胞菌小鼠的肺组织TLR4表达及相关炎症因子的影响.方法 采用气道接种含铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的琼脂糖于Balb/c小鼠,感染后第7天起分别予低剂量阿奇霉素和生理盐水治疗,并于感染后第7、10、14天分别进行支气管肺泡灌洗液中炎性因子IL-6和IL-17的ELISA检测以及肺组织TLR4 mRNA表达水平的定量PCR分析,同时进行肺组织细菌培养、肺泡灌洗液白细胞计数和肺组织病理检查.接种无菌琼脂糖的小鼠做空白对照组.结果 阿奇霉素组的小鼠在治疗后肺部感染症状明显改善.感染后第7天,感染PA小鼠肺组织病理损伤程度、细胞因子及TLR4mRNA表达均高于对照组.感染后第10、14天,阿奇霉素组小鼠的IL-6、IL-17及TLR4 mRNA的表达量显著低于同时间点的生理盐水组.第14天时,阿奇霉素组小鼠的IL-17已降至对照组IL-17水平.结论 在PA感染初期,低剂量阿奇霉素的治疗可通过下调TLR4表达发挥抗炎作用.
-
广西人群TLR4基因3'-非编码区单核苷酸多态性的研究
目的 通过对TLR4 (Toll-like receptor4)基因3'-非编码区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因型和等位基因的研究分析,了解其在广西地区人群的频率分布及其在不同地区、种族之间分布是否存在差异.方法 采用DNA测序方法和单碱基延伸PCR技术检测广西地区人群TLR4基因3'-非编码区rs11536889G/C多态性,并比较广西地区人群与人类基因组计划研究的4个人群(欧洲、中国北京、日本、非洲)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)以及韩国地区人群SNP分型数据,以分析TLR4基因rs 11536889G/C基因型和等位基因在不同地区人群中的分布差异.结果 广西地区人群的TLR4基因3'-非编码区rs11536889G/C位点的分布频率在男性、女性组间无差异(P＞0.05).与日本、韩国、中国北京地区人群比较分布差异无统计学意义(P＞0.05);而与欧洲、非洲地区人群比较,分布有显著性差异(P＜0.05).结论 广西地区人群TLR4基因3'-非编码区单核苷酸多态性与其它地区、种族人群之间存在统计学差异.
-
大鼠siTLR4重组腺病毒载体的构建及功能鉴定
目的 构建特异性针对大鼠TLR4基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究TLR4在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础.方法 设计并合成3对大鼠TLR4基因的siRNA序列,退火处理后定向克隆到pSES-HUS穿梭质粒中,获得pSES-HUS siTLR4,经Pme Ⅰ线性化后与pAdEasy-1骨架质粒在BJ5183细菌中进行同源重组,从而构建pAd-siTLR4质粒,通过脂质体转染,在HEK293细胞中包装形成Ad-siTLR4腺病毒颗粒,用该病毒感染PC12细胞,从基因和蛋白质水平分别检测3对siTLR4的抑制效果,同时从蛋白质水平检测TLR4 下游关键分子NF-κB的表达.结果 PCR、酶切和测序均证实目的基因正确克隆到所构建的pAd siTLR4重组腺病毒载体中;经包装获得的Ad -siTLR4病毒颗粒在PC12细胞中能够有效地抑制TLR4 mRNA和蛋白水平的表达,并显著地降低了NF- κB的表达.结论 成功构建了pAd-siTLR4重组腺病毒质粒,同时包装获得了 Ad -siTLR4重组腺病毒,转染PC12细胞后不仅能明显降低TLR4的表达,而且有效地抑制了TLR4通路下游关键分子NF-κB的表达.
-
人TLR2和TLR4胞外区cDNA的克隆
目的 从脂多糖诱导的外周血单个核细胞克隆人Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)胞外区cDNA.方法 用不同浓度脂多糖在不同时间刺激单个核细胞后提取总RNA,RT-PCR方法半定量测定TLR2和TLR4的表达,应用pUCm-T载体克隆胞外区cDNA,双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果 单个核细胞在四种浓度脂多糖刺激3 h,6 h和12 h后.TLR2和TLR4表达并不相同.15 μg/mL脂多糖作用6 h TLR2表达高,10 μg/mL脂多糖作用3 hTLR4表达高.经RT-PCR扩增TLR2和TLR4胞外区cDNA分别为1 700 bp和1 900 bp,T载体克隆、酶切鉴定及测序分析后证实,目的 片段与GenBank中序列一致.结论 脂多糖的诱导对外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达有显著影响,并且成功克隆了胞外区cDNA.
-
TLR2和TLR4的TLR/IL-1 receptor结构与功能
Toll样受体(Toll like receptor,TLR)是架接固有免疫和适应性免疫的桥梁.迄今为止,已鉴定的人TLR有10种,分别命名为TLR 1～TLR 10,TLR是一种Ⅰ型跨膜蛋白,由胞外富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域,胞内保守的Toll/IL-1受体(TIR)结构域和跨膜结构域构成.TLRs在识别病原体相关分子模式后,其信号的特异转导主要取决于TLRs的TIR功能域与下游接头分子的TIR功能域的特异相互作用.然而,TLR2和TLR4的TIR功能域在其与下游接头分子Mal和MyD88相互作用、以及TLRs同源或异源二聚化方面的作用模式存在明显的差异.本文就TLR2和TLR4的TIR结构与功能进行简要综述,有助于我们进一步了解TLR TIR功能域与下游接头分子的相互作用.
-
卡介苗吸入对肺炎大鼠肺Toll样受体mRNA的影响
TLR是近年来新发现的一种同源于果蝇Toll的蛋白分子,在宿主天然免疫中具有重要作用.Becker等用RT-PCR法证明TLRs1～6在人呼吸道上皮细胞中也有明显表达[1].本文首次通过卡介苗吸入,探讨对呼吸道炎症时大鼠活体内肺TLR2、TLR4mRNA表达的影响.
-
人TLR4胞外区cDNA克隆及其酵母表达载体的构建
研究表明:TLR4是哺乳动物LPS作用的受体,介导LPS的生理和病理效应[1～3].有关研究取得明显的进展,但对于其识别的配体目前还未阐明.新近发现并广为应用的酵母双杂交技术给上述研究提供了新的机遇.因此,本研究克隆TLR4胞外区cDNA,并构建酵母双杂交系统的靶基因,为进一步利用该系统研究与TLR4相互作用的蛋白质奠定基础.
-
TLR4基因3'未翻译区11367位点多态性与儿童哮喘相的相关性
目的 探讨TLR4基因3'未翻译区(3'UTR)11367位点的多态性在儿童哮喘人群中的分布及其与患儿特应质、肺炎支原体感染、过敏原和肺功能参数的关系.方法 本研究纳入哮喘患儿222例,正常对照290例.采用单管双向等位基因特异性扩增技术(SB-ASA)检测TLR4基因3'UTR 11367位点的基因多态性.使用被动凝集法检测血清肺炎支原体抗体滴度.通过皮肤点刺试验(Skin prick test,SPT)检测常见过敏原.结果 哮喘组中TLR4 G11367C位点基因型GG、GC/CC的频率分别是89.6%和10.4%,等位基因G、C的频率分别是93.8%和6.2%,与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);相较于GC型,GG型的哮喘患儿湿疹史更高(P=0.024,OR=2.957,95%CI为1.117～7.828),屋尘螨过敏程度也较GC型重(P=0.021);GG型和GC型患儿肺功能水平没有显著性差异.结论 TLR4基因3'UTR基因多态性与儿童哮喘易感性不相关,但与哮喘患儿有无湿疹史及屋尘螨的过敏程度相关.
-
血管平滑肌细胞TLR4与动脉粥样硬化发展关系的研究进展
目前动脉粥样硬化(AS)被认为是一种慢性炎症过程,Toll样受体4(TLR4)通过激活天然免疫,参与特异性免疫应答的启动,促进炎症的发展,在AS中发挥了重要作用.同时在AS发展过程中血管平滑肌细胞(VSMC)发生增殖、迁移,并分泌细胞因子、趋化因子、蛋白酶等,促进AS 的发生、发展.此外,TLR4与VSMC之间存在一定的相互作用,对AS的不同阶段产生影响.
-
失血性休克后小鼠肺组织TLR4受体表达及其意义
目的探讨单纯性失血性休克(无复苏)后肺组织TLR4表达变化及意义.方法C57BL/6小鼠随机分为失血性休克组、脂多糖(LPS)刺激组、假手术组.复制各组动物模型,在不同时间点取出肺组织,通过免疫组化方法,观察TLR4在肺组织的表达变化.结果在失血性休克和LPS刺激后肺部出现明显的中性粒细胞浸润、红细胞渗出.在失血性休克1、2及4 h后,肺巨噬细胞、肺泡上皮细胞及肺间质TLR4表达逐渐增加,6 h开始下降;而LPS刺激后1、2、4及6 h肺TLR4表达逐渐增加.假手术组未见TLR4表达.结论失血性休克后肺TLR4变化可能与急性肺损伤(ALI)的发生有关.失血性休克及LPS刺激后肺组织TLR4变化增强了机体的非特异性免疫能力,同时增加了宿主对随后各种刺激的易感性,过度表达的TLR4可能造成组织、器官结构和功能的损害.
-
TLR4启动子遗传变异及环境交互与不明原因复发性流产易感性的关系
目的:研究TLR4启动子区二个位点rs10983755及ss77136219的A→G多态性变异及环境因素交互与南方女性不明原因复发性流产(URSA)易感性的关系.方法:将240例健康对照组与183例URSA患者外周血DNA进行TLR4-ss77136219及TLR4-rs10983755二个位点的基因分型,分成-AA/AG/GG 3种,比较不同基因型在URSA组及对照组发病率的差异；同时进行环境致病因素的多中心问卷调查,建立Logistic多元回归模型,计算以上基因变异及环境因素交互与URSA发病的易感性关系.结果:TLR4-ss77136219 A＞G变异与URSA易感性相关,GG及GA基因型为URSA的易感基因型,且该位点变异与年龄≥30岁之间存在着基因-环境交互作用.结论:ⅡR4-ss77136219-GG/GA基因型与URSA发病易感性相关,而TLR4 -ss77136219 -AA基因型为URSA保护性基因型；且TLR4-ss77136219-GG/GA与年龄≥30岁之间存在协同作用,URSA是一种基因-环境多因素交互的复杂性疾病.
-
TLR4/MyD88信号通路与结直肠癌相关性的研究进展
结直肠癌是危害人类健康的恶性肿瘤之一,在全世界其发病率和死亡率分别居第2 位和第4位.目前中国内地结直肠癌发病率以4.71%逐年递增,远超2%的国际水平,居我国癌症死因的第4位、第5位.尽管目前的规范化综合治疗在很大程度上延长了晚期结直肠癌患者的生存期,结果仍然不能令人满意.大量研究显示To11样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信号通路是介导机体炎症和免疫的桥梁,诸多学者对其进行深入研究,发现TLR4、MyD88在结直肠癌细胞及组织中也均有表达,且TLR4可能通过不同的信号转导途径促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡及免疫逃逸,这些机制参与炎症相关性肿瘤的发生、发展.本文就肠道慢性炎症与结直肠癌发生、进展的关系,及TLR4/MyD88信号通路在其中的作用机制进行综述.
-
基于分子对接方法的青藤碱对TLR4受体的分子作用机制研究
目的:研究青藤碱对TLR4的分子作用机制.方法:通过分子对接技术对青藤碱与TLR4-MD-2复合体间的相互作用进行研究.结果:TLR4-MD-2识别脂多糖的空腔主要为疏水区域,空腔较大,可以容纳3个青藤碱分子,它们均可稳定结合在疏水空腔内,通过构型互补的方式占据空腔.其中青藤碱与MD-2的活性位点残基Val48、Ile52、Leu61、Phe76、Ile94、Tyr102、Ile117、Phe151、Ile153形成较强的疏水作用;第三次对接的青藤碱与Tyr102形成氢键作用,氢键长度为2.80?.结论:青藤碱能够通过疏水作用和氢键作用结合TLR4-MD-2复合体,从而影响TLR4对脂多糖的识别.
-
参苏饮对“肺气虚外感”小鼠肺组织BD-2、TLR4、NFκB p65蛋白的影响
目的:研究参苏饮对肺气虚外感小鼠肺组织BD-2、TLR4、NF-κB蛋白的影响.方法:将动物按体重随机分为空白组和模型组,用烟熏法建立小鼠“肺气虚外感”证模型,免疫组化(SP法)测定小鼠肺组织BD-2、TLR4、NF-κB蛋白的变化.结果:模型组小鼠肺组织中NF-κB p65、BD-2、TLR4蛋白的含量均显著升高(P＜0.05);全方组、益气解表组、止咳化痰组小鼠肺组织中NF-κB p65、BD-2、TLR4蛋白的含量均显著地下降(P＜0.05);全方组、益气解表组、止咳化痰组之间无统计学差异(P＞0.05).结论:参苏饮能促进“肺气虚外感”小鼠肺组织BD-2、TLR4、NFκB蛋白的表达,提示参苏饮能够促进“气虚外感证”BD-2的表达与“TLR4-NFκB”信号通路有相关性.
-
TLR4对胃癌细胞放射敏感性的影响探讨
目的 探讨Toll样受体4(TLR4)对肿瘤细胞放射敏感性的影响.方法 小鼠胃癌细胞株MFC分别经脂多糖(LPS)、瑞沙托维(TAK-242)和磷酸缓冲液(PBS)处理后进行5 Gy照射和0 Gy照射,分析MFC细胞TLR4表达情况、增殖活性、放射敏感性、凋亡率和细胞周期变化.结果 MFC细胞经5 GyX射线照射24 h后TLR4表达水平显著下降;增殖活性、放射敏感性显著下降,凋亡率显著升高;细胞阻滞于G2/M期.经TAK-242和LPS处理后增殖活性、放射敏感性等均发生不同程度改变.结论 TLR4可对胃癌细胞放射敏感性产生较大影响.
