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黄连素对肥胖胰岛素抵抗大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的干预研究
目的 探讨黄连素改善肥胖胰岛素抵抗大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的可能机制.方法 40只Wistar大鼠分为高脂组(HF组,30只)和正常对照组(NC组,10只).成模后处理NC组10只及HF组10只大鼠.检测血浆中内毒素(ET)水平,RT-PCR检测骨骼肌中Toll样受体4(TLR4) mRNA,Western blot检测骨骼肌TLR4、IκB激酶(IKKβ)、IKKβ 181位丝氨酸磷酸化(p-IKKβSer181、核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达,胰岛素受体(IR)与胰岛素受体底物(IRS)-1总蛋白及磷酸化水平.余20只肥胖大鼠分为黄连素干预组(FB组,10只)及肥胖模型对照组(FC组,10只),继续高脂饮食喂养,FB组予200 mg/(kg·d)每日1次黄连素灌胃,FC组予等量蒸馏水灌胃,持续8周后检测以上指标.结果 肥胖大鼠血浆中ET水平升高,且骨骼肌TLR4/IKK3/NF-κB内毒素信号通路激活,炎症因子TNF-α蛋白表达增加,黄连素干预使肥胖胰岛素抵抗大鼠血浆中ET水平降低,且骨骼肌组织TLR4/IKKβ/NF-κB内毒素信号通路各蛋白及TNF-α蛋白表达均下调,IR及IRS-1酪氨酸磷酸化水平均升高(P＜0.05).结论 黄连素可改善肥胖胰岛素抵抗大鼠骨骼肌胰岛素抵抗,其机制可能是通过下调骨骼肌TLR4/IKKβ/NF-κB内毒素信号通路减少炎症因子TNF-α产生所致.
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灵芪蠲肝液对大鼠TLR4信号途径的影响
目的:探讨四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝损伤的作用机制,并观察灵芪蠲肝液对Toll样受体4(TLR4)信号传导途径的影响.方法:雄性健康Wistar大鼠,设置模型组、灵芪蠲肝组（治疗组）和空白组.用40％ CCl4花生油溶液皮下注射建立慢性肝损伤模型,以灵芪蠲肝液灌胃作治疗性研究,于第8周收集血液和肝脏组织.检测肝功能ALT 、AST、白蛋白(ALB)水平；检测血清内毒素、白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平；分离枯否细胞(KCs),采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR）检测KCs TLR4 mRNA表达；肝组织HE染色,按Knodell HAI评分标准对肝脏炎症评分,免疫组化SP法检测肝组织TLR4和核因子κB(NF-κB)蛋白表达.结果:空白组除ALB高于模型组和治疗组外,其余指标均低.模型组血清ALT、AST、内毒素、IL-1β、TNF-α水平明显高于治疗组(P＜0.001),ALB水平明显低于治疗组(P＜0.05),KCs TLR4 mRNA表达明显高于治疗组(P＜0.001),肝组织炎症Knodell HAI评分、TLR4和NF-κB蛋白均高于治疗组(P＜0.001).结论:①通过TLR4信号传导途径释放炎症介质致肝组织损伤可能为CCl4诱导慢性肝损伤的机制之一.②灵芪蠲肝液治疗慢性肝损伤的机制可能与抑制TLR4信号途径有关.
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丁苯酞对Aβ1-42的诱导HBMEC细胞凋亡及 TLR4/COX-2表达的影响
目的:研究丁苯酞对Aβ1-42诱导的HBMEC细胞凋亡的影响以及TLR4/COX-2的表达情况.方法:将HBMEC分为阴性对照组、Aβ1-42组、TAK242组(10 nmol/L)、DMSO组(1‰)和丁苯酞组(160、80、40μg/L).采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫印迹法检测细胞中TLR4、COX-2蛋白的表达情况.结果:同阴性对照组比较,Aβ1-42组细胞早期凋亡率上升,TLR4、COX-2蛋白表达增加;与Aβ1-42组比较,TAK242组和丁苯酞组细胞凋亡率降低,TLR4、COX-2蛋白表达减少,比较结果有统计学意义(P<0.05).结论:丁苯酞对Aβ1-42所致的HBMEC细胞凋亡有保护效应,能降低细胞TLR4、COX-2蛋白的表达,其保护效应可能与抑制细胞TLR4、COX-2蛋白的表达有关.
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TLR4在慢性支气管炎大鼠气道粘液高分泌中的作用
目的：观察 TLR4在细菌内毒素(LPS)致慢性支气管炎大鼠气道粘液高分泌中的作用。方法 SPF 级雄性Wistar 大鼠40只,随机分为4组,正常对照组(NS 组)10只,慢性支气管炎组(LPS 组)10只,多粘菌素 B 干预组(LPS +PMB 组)10只,多粘菌素 B 自身对照组(PMB 组)10只。用气管内注入 LPS 200μg/200μL 及每日 LPS 溶液雾化吸入1h 的方法建立慢性支气管炎动物模型,3周后对大鼠肺脏进行病理学检查,肺组织阿先蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)阳染面积,用免疫组化法观察粘蛋白 Muc5AC、TLR4在支气管肺内的表达及荧光定量 RT-PCR Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA 在肺内的表达。结果 LPS 组在 AB-PAS 阳染面积、粘蛋白 Muc5AC、TLR4蛋白及 Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA 表达与 LPS + PMB组比较差异有统计学意义(P <0．05),NS 组和 PMB 组在上述指标则组间差异无统计学意义(P >0．05)。结论 TLR4介导 LPS 诱发的慢性呼吸道炎症反应可能导致气道粘蛋白基因 Muc5AC mRNA 的高表达和粘蛋白 Muc5AC 的高分泌。多粘菌素 B 可能通过抑制肺组织 TLR4 mRNA 及其蛋白的表达而抑制气道粘液高分泌。
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乌司他丁对脓毒血症鼠小肠脂联素及TLR4表达的影响
目的：探讨乌司他丁对脓毒血症鼠小肠脂肪组织APN mRNA表达的影响及与TLR4的关系。方法30只Wistar大鼠随机分为健康对照组(C组,10例)、LPS组(L组,10例)和乌司他丁组(U组,10例),给予乌司他丁48h后处死大鼠,分别于注射前0h、注射后2h、4h、8h、24h、48h检测大鼠血清APN及IL-1、IL-6、TLR4水平,处死大鼠后取小肠脂肪组织检测APN mRNA和TLR4 mRNA的表达情况。结果三组大鼠在注射前0h及注射后2h血清APN水平及IL-1、IL-6、TLR4水平差异无统计学意义(P>0.05)；注射后4h、8h、24h、48h,L组与U组大鼠血清APN水平明显低于C组,IL-1、IL-6、TLR4水平明显高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)；与L组相比,注射后4h、8h、24h、48h,U组大鼠血清APN水平明显高于L组,而IL-1、IL-6、TLR4水平明显低于L组,差异有统计学意义(P<0.05)；与C组相比,L组与U组大鼠小肠脂肪组织APN mRNA水平较C组明显降低,L组降低幅度更大,而TLR4 mRNA表达则明显升高,且L组升高幅度更大,差异有统计学意义(P<0.05)。结论乌司他丁可以提升脓毒血症鼠脂联素水平,减少TLR4表达及炎症因子释放,从而减轻炎症反应。
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TLR4在慢性支气管炎大鼠气道粘液高分泌中的作用及多粘菌素B干预的影响
目的 观察TLR4在细菌内毒素(LPS)致慢性支气管炎大鼠气道粘液高分泌中的作用及多粘菌素B(PMB)干预的影响,并探讨其可能的机制.方法 SPF级雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组(NS组)、慢性支气管炎组(LPS组)、多粘菌素B干预组(LPS+ PMB组)和多粘菌素B自身对照组(PMB组)各10只.用气管内注入LPS 200μg/200μl及每日LPS溶液雾化吸入1小时的方法建立慢性支气管炎动物模型,3周后收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞学计数和白细胞分类检测,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,病理学检测大鼠肺组织阿先蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)阳染面积,用免疫组化法检测粘蛋白Muc5AC、TLR4在支气管肺内的表达及荧光定量RT-PCR法检测Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA在肺内的表达.结果 LPS组在BALF中细胞总数、中性粒细胞、TNF-α含量及AB-PAS阳染面积、粘蛋白Muc5AC、TLR4蛋白及Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA表达与LPS+ PMB组比较,差异均有显著性(均P＜0.05),NS组和PMB组上述指标间差异无显著性(P＞0.05).结论 TLR4介导LPS诱发的慢性呼吸道炎症反应可能导致气道粘蛋白基因Muc5AC mRNA的高表达和粘蛋白Muc5AC的高分泌.PMB可能通过抑制肺组织TLR4 mRNA及其蛋白的表达而抑制气道粘液高分泌.
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SIGIRR对LPS诱导的H292细胞TLR4表达的影响
目的 通过上调SIGIRR(single Ig IL-IR-related molecule)在人气道上皮细胞株H292中的表达,研究SI-GIRR对LPS诱导的H292细胞TLR4表达的影响.方法 构建SIGIRR-EGFP融和蛋白的真核表达载体,运用脂质体转染的方法 转染人气道上皮细胞株H292,经LPS刺激后,ELISA检测转染前后上皮细胞TNF-a分泌水平的差异,Western blot(WB)检测TLR4表达的变化.结果 构建的融和蛋白表达裁体SIGIRR-EGFP经EcoRI和BamHI双酶切后,电泳显示其条带大小为4.7kb和1.23kb左右,经测序证实SIGIRR的序列与GenBank公布的人cDNA序列完全一致.SIGIRR-EGFP转染细胞与pEGFP-N1转染细胞和对照组细胞相比,TNF-a产生明显下降,而TLR4表达无明显变化.结论 SIGIRR上调表达可抑制LPS诱导的H292细胞TNF-a的产生,对TLR4表达无影响,提示SIGIRR在该信号通路中起"刹车"作用可能是通过抑制其下游通路中某个或某些调节蛋白的表迭完成的.
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罗格列酮、5-ASA 和VSL#3对SW480细胞TLR4、PPAR γ、NF-κB表达的影响
目的 探讨罗格列酮、5 - ASA和VSL#3对SW480细胞TLR4 - NF - κB信号途径关键位点蛋白表达的影响.方法 SW480细胞分为5组,4组以脂多糖(LPS)50 ng/ml刺激24 h,另一组仅加入无LPS的RMPI 1640为对照组.刺激后,3组分别以罗格列酮(10 μmol/L)、5 - ASA(1 mg/ml)和VSL#3(0.01 g/ml)干预2 h.收集各组上清液,用WB法检测各组TLR4、NF - κB、PPAR γ蛋白的表达,用ELISA法测量IL - 8生成量.结果 VSL#3明显减少TLR4表达,促进PPAR γ表达,抑制NF - κB活化;罗格列酮、5 - ASA明显促进PPAR γ表达,阻止NF - κB活化,对TLR4基本无影响.LPS组IL - 8生成量明显高于对照组;罗格列酮、5 - ASA、VSL#3干预可明显降低IL - 8生成量.结论 TLR4 - NF - κB信号途径是重要的信号通路,PPAR γ对这条信号通路有抑制作用.VSL#3通过同时降低TLR4表达和增加PPAR γ的表达,抑制NF - κB的活性,抑制这条信号通路,终缓解炎症.罗格列酮的作用可能主要是通过增加PPAR γ表达和促进其活性实现.PPAR γ是5 - ASA的作用靶点之一.
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PCI术后应用阿托伐他汀对ACS患者TLR4表达的影响
目的 探讨经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后应用阿托伐他汀对急性冠状动脉综合征(ACS)患者Toll样受体4(TLR4)表达的影响.方法 将ACS患者124例分为观察组62例与对照组62例,入院后均择期行PCI术联合阿托伐他汀常规治疗,对照组给予常规剂量阿托伐他汀,观察组给予负荷剂量阿托伐他汀.比较两组治疗前后TLR4表达情况及术后心血管事件(MACE)的发生情况.结果 治疗后3个月,两组左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内经(LVESD)显著高于治疗前(P＜0.05),且观察组高于对照组(P＜0.05);两组治疗前后左室间隔厚度(LVIVS)、左心室后壁厚度(LVPWT)无显著变化(P＞0.05).治疗后3个月,两组血TLR表达水平显著低于治疗前(P＜0.05),且观察组显著低于对照组(P＜0.05).术后随访1年,观察组的MACE发生率显著低于对照组(P＜0.05).结论 在择期PCI术后应用负荷剂量阿托伐他汀能降低ACS患者的TLR4表达水平,改善患者的心功能,降低患者远期MACE的发生率,有很好的应用价值.
关键词： 负荷剂量 阿托伐他汀 经皮冠状动脉介入治疗 急性冠状动脉综合征 TLR4 -
全身炎症反应综合证发生的分子机制研究进展
二十世纪九十年代初,美国胸科医师学会与危重病急救医学会提出了全身炎症反应综合证(gystemic inflammatory response syndrome,SIRS)这一概念,并具有以下两项或两项以上的体征即可诊断为SIRS:(1)体温＞38℃或＜36℃;(2)心率＞90次/min;(3)呼吸频率＞20次/min,或PaCO2＜4.3kPa;(4)细胞计数＞12×109/L或＜4×109/L,其中未成熟中性白细胞＞10.0%.SIRS的基本诱因是严重的创伤和感染,而由感染引发的SIRS称为脓毒症(sepsis);多器官功能不全综合证(multiple orgen dysfunction syndrome,MODS)则是由于创伤、感染和体克等应激打击导致的全身炎症反应失控造成的急性多系统或器官功能损害,其中感染造成的MODS常见,许多学者认为MODS是SIRS的进一步发展.
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脓毒症及脓毒性休克大鼠脑细胞TLR4和TNF-α的表达及细胞凋亡研究
目的 目的观察脓毒症及脓毒性休克时期大鼠脑细胞Toll样受体4(tol-like receptor4,TLR4)及肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)的表达及脑细胞凋亡情况.方法 1. 建立动物模型及分组:72只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组、脓毒症组及脓毒性休克组,脓毒症组腹腔注射10 mg/kg内毒素、脓毒性休克组腹腔注射12 mg/kg内毒素建立大鼠模型、正常对照组腹腔注射12 mg/kg生理盐水;2. 各组大鼠在注射后1 h、6 h、24 h处死,每时点每组各8只,采集脑组织标本;标本制作石蜡切片,采用原位杂交探针序列,进行TLR4及TNF-α的mRNA原位杂交检测;TUNEL(原位末端1转移酶标记技术)法测定细胞凋亡.结果 TLR4、TNF-α及脑细胞凋亡在脓毒症及脓毒症休克组大鼠脑组的织表达在LPS攻击后1 h、6 h、24 h随时间呈上升趋势,且每个时段脓毒症组、脓毒性休克组均显著高于对照组,脓毒性休克组显著高于脓毒症组(P均＜0. 05).结论 TLR4及TNF-α在脓毒症,尤其是在脓毒性休克大鼠脑细胞的高表达,与重要脏器组织细胞凋亡有关.
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肠炎清对ICUC大鼠结肠组织TLR4、NF-KB蛋白表达、TLR4mRNA的影响
目的 通过观察肠炎清对免疫复合溃疡型结肠炎模型(ICUC)大鼠结肠组织Toll样受体4(TLR4)和核因子-κB(NF-κB)表达的影响,探讨肠炎清治疗IBD的作用机制.方法 采用三硝基苯磺酸(TNBS)加免疫复合法造模.将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、肠炎清低、中、高剂量组(8.33、16.67、33.33mL/kg)、柳氮磺吡啶(SASP)组(0.5g/kg).造模后第2d,用药组分别给予相应药物灌胃7d,给药7天后麻醉处死大鼠,取新鲜结肠标本,采用免疫组化法检测TLR 4、NF-κBp65的表达,实时定量PCR法(qRT-PCR)检测TLR 4mRNA的表达.结果 免疫组化结果:NF-κBp65和TLR4在各组各只动物均可见阳性表达,其中肠炎清高剂量组及SASP组可显著下调NF-κBp65的表达,有统计学差异(P＜0.05).TLR4在各给药组与模型组比较未见显著差异(P＞0.05).PCR结果:与模型对照组相比,各给药组大鼠结肠组织TLR4表达均为阳性,但未见统计学差异(P＞0.05).结论 下调TLR4、NF-κBp65的表达,是肠炎清治疗IBD的作用机制之一.
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巨噬细胞中oxLDL对TLR4-Src信号通路激活的调控
目的 探讨氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)对于巨噬细胞中Toll样受体4 (toll like receptor 4,TLR4)-Src信号通路激活的调控作用.方法 oxLDL (50 ug/mL)按不同时间(0、15、30和60 min)刺激巨噬细胞,同时采用特异性siRNA抑制巨噬细胞内TLR4表达后,Western blot检测Src-Y418位点磷酸化水平;并利用免疫共沉淀法及细胞免疫荧光法检测TLR4与Src及其家族相似蛋白Fyn和Lyn的体外结合情况.结果 oxLDL诱导巨噬细胞内Src-Y418磷酸化水平显著性升高,且呈时间相关性.而抑制TLR4表达则可显著性削弱oxLDL对于Src的激活作用(P＜0.01).此外,oxLDL诱导细胞内TLR4与磷酸化Src (p-Src)相互结合并共定位于细胞膜表面,而不与Src其他家族成员Fyn及Lyn结合.结论 oxLDL通过诱导TLR4与Src相互结合,从而激活Src磷酸化水平,进而诱发动脉粥样硬化过程中脂质累积及炎症反应.
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加味防己黄芪汤对原发性肾病综合征微炎状态及Toll样受体相关蛋白的影响
目的:观察加味防己黄芪汤对脾肾阳虚型原发性肾病综合征的临床疗效及对相关指标的影响.方法:随机选取脾肾阳虚型原发性肾病综合征患者100例,随机分为观察组和对照组各50例,其中对照组予西医常规治疗,观察组在此基础上给予加味防己黄芪汤口服治疗,分别观察治疗前、后两组临床症状、生化指标(24h尿蛋白、Alb、CHOL)、炎性指标(hs-CRP、IL-8)、凝血状态(PT、PLT)及Toll样受体相关蛋白(TLR4和TLR7)的变化.结果:①观察组总有效率为84.00％,而对照组总有效率为66.00％,两组总有效率具有统计学意义(P<0.05).②治疗24 h尿蛋白和CHOL均明显减少(P<0.05),而Alb显著升高(P<0.05),其中观察组24 h尿蛋白和CHOL的下降程度及Alb的提高程度均优于对照组(P<0.05).③治疗后两组Hs-CRP和IL-8均明显下调(P<0.05),观察组Hs-CRP和IL-8的下调程度优于对照组(P<0.05).④治疗后两组PT均明显增加(P<0.05),观察组PT的增加程度优于对照组(P<0.05),而PLT治疗后两组均减小(P<0.05),然两组各自PLT的减小程度未见明显差异(P>0.05).⑤治疗后两组TLR4和TLR7均明显降低(P<0.05),观察组TLR4和TLR7降低程度优于对照组(P<0.05).结论:在成人原发性肾病综合征的治疗中,加味防己黄芪汤能有效缓解其临床症状提高疗效,其疗效机制可能与改善患者微炎状态、凝血状态和T o ll样受体相关蛋白有关.
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柴胡皂苷d-黄芩苷配伍对CCl4诱导大鼠HSC的TLR4-NF-κB通路作用研究
目的:探讨柴胡皂苷d-黄芩苷(SaikosaponinD-Baicalin,SB)对CCl4诱导肝星状细胞(Hepat-ic stellate cell,HSC)的作用机制.方法:HSC分空白对照(无药物处理),CCl4诱导(6 mmol/LCCl4作用6h),给药(6mmol/L CCl4作用6h后,2.5、5、10ug/ml的SB作用24 h),TAK-242、BYA 11-7082组(6 mmol/L CCl4作用6 h后,TAK-24210 mol/L、BYA 11-70822 mol/L作用24 h).ELISA法检测透明质酸酶(Hyaluronidase,HA)、层粘连蛋白(Laminin,LN)、III型前胶原(ProcollagenⅢ,PCIII)、IV型胶原(Collagen Type IV,IV-C)浓度,RT-PCR、Western blot方法检测细胞中Toll样受体4(Toll-like receptors4,TLR4)、核转录因子(NF-κB)基因、蛋白的表达.结果:与CCl4干预组比较,SB、TAK-242、BYA 11-7082可降低CCl4造成的HSC细胞增殖,HA、LN、PCIII、HA细胞释放水平及NF-κB基因、蛋白的表达.SB、TAK-242可下调TLR4基因、蛋白表达.结论:SB可以抑制CCl4诱导的炎症因子基因、蛋白表达,改善肝纤维化相关指标,其作用机制可能与TLR4-NF-κB转录活性及蛋白活性相关.
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重度烧伤大鼠肠道组织HMGB1和TLR4表达增强且肠道免疫功能紊乱
目的 探讨重度烧伤大鼠肠道高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)的表达及其与肠道免疫功能的关系.方法 取40只雄性SD大鼠,随机分为对照组10只、重度烧伤组30只.对照组仅麻醉,重度烧伤组大鼠背部及腹侧造成全身60％烫伤.烧伤组大鼠在伤后6、12、18 h,各取10只颈椎脱臼处死,对照组大鼠10只麻醉后即刻处死.采用Westernblot法检测肠组织中HMGB1和TLR4蛋白水平,流式细胞术测量CD3+T细胞的纯度和Th1细胞和Th2细胞亚群比率,ELISA检测肠组织匀浆γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和IL-10含量.结果 与对照组相比,重度烧伤组伤后6、12、18 h,大鼠肠道组织中HMGB1和TLR4蛋白水平均显著高于对照组,且随着烧伤后时间的增加,蛋白水平均逐渐增加,重度烧伤组HMGB1及TLR4蛋白表达呈正相关.烧伤组伤后6、12、18 h,Th1细胞亚群比例显著增加,而Th2细胞亚群比例降低,Th1细胞/Th2细胞比值显著增加,Th1细胞比例与HMGB1及TLR4呈正相关,而Th2细胞比例与HMGB1及TLR4呈负相关.与对照组相比,重度烧伤组伤后6、12、18 h,大鼠肠道IFN-γ及IL-4水平均显著增加,而IL-10水平显著降低.且随着烧伤后时间的增加,IFN-γ及IL-4水平均逐渐增加,而IL-10水平逐渐降低.结论 大鼠重度烧伤后,肠道组织内募集HMGB1激活TLR4信号通路,进一步激活下游信号转录因子,并释放一系列炎性细胞因子引起炎症反应,从而参与大鼠Th1细胞和Th2细胞介导的免疫功能障碍.
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槐定碱抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子分泌及机制
目的 观察槐定碱对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)时,对Toll样受体4(TLR4)、c-Jun表达的影响,探讨槐定碱抗LPS分子机制.方法 培养RAW264.7细胞,实验分为4组:巨噬细胞对照组,以无血清DMEM孵育细胞;槐定碱处理组,以含31.25 mg/L槐定碱DMEM孵育细胞;LPS组及LPS刺激后槐定碱处理组,分别以浓度为100 μg/L LPS DMEM孵育细胞60 min后弃去LPS,而后分别加入无血清DMEM或31.25 mg/L槐定碱DMEM继续培养.以上4组分别于处理完毕后5、30、60、120 min收集细胞及培养液.采用反转录PCR检测RAW264.7细胞TLR4、c-Jun mRNA的表达,Western blot法及免疫细胞化学技术检测RAW264.7细胞c-Jun蛋白的表达;ELISA检测培养液中TNF-α、IL-1β分泌量.结果 槐定碱处理组与巨噬细胞对照组各指标间未见显著性差异;LPS组各时间点RAW264.7细胞的TLR4、c-Jun mRNA及c-Jun蛋白表达,培养液中TNF-α、IL-1β分泌量均显著高于巨噬细胞对照组,并维持至120 min未见下降;LPS刺激后槐定碱处理组显著抑制LPS刺激的RAW264.7细胞TLR4、c-Jun mRNA及c-Jun蛋白表达,并减少TNF-α、IL-1 β分泌.结论 槐定碱通过抑制TLR4及c-Jun表达,下调LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β的分泌.
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连翘酯苷A对脂多糖诱发的小鼠急性肺损伤的保护作用
目的 研究中药单体连翘酯苷A对脂多糖(LPS)诱发小鼠急性肺损伤的保护作用及可能机制.方法 采用腹腔注射LPS(10 mg/kg体质量)建立内LPS诱发急性肺损伤小鼠模型;实验分正常对照组,急性肺损伤模型组,抗体组,连翘酯苷A高、中、低剂量组;其中抗体组在造模前12 h前腹腔注射抗小鼠Toll样受体4/髓样分化蛋白2(TLR4/MD2)复合物抗体(50 μg/20 g体质量),连翘酯苷A干预组在造模前7d腹腔注射连翘酯苷A1次/d,剂量分别为(80、20、5)mg/kg体质量;各组小鼠在造模4h后留取血和肺组织,动态浊度法检测血浆内毒素的含量,HE染色法观察肺组织病理的改变,RT-PCR和Western blot法测定肺组织TLR4的表达,免疫组化测定肺组织MyD88和NF-κB的表达,ELISA检测血清中TNF-α的含量.结果 与正常组相比,模型组血浆中内毒素含量显著升高,肺泡间隔明显增厚,充血,水肿及大量的中性粒细胞浸润;与模型组相比,连翘酯苷A用药各组血浆内毒素含量明显下降(P＜0.01),肺组织病理损伤不同程度的减轻,TLR4 mRNA和蛋白的表达明显下调(P＜0.01),MyD88和NF-κB蛋白的表达也显著降低(P＜0.01),血清中TNF-α的含量降低,连翘酯苷A干预各组呈剂量依赖关系.结论 连翘酯苷A对LPS诱发的急性肺损伤小鼠起保护作用,其机制可能与其抑制LPS-TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关.
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TLR4、MyD88、NF-κBmRNA在实验性自身免疫性肌炎小鼠淋巴结中的表达及意义
目的:研究TLR4、MyD88、NF-κB mRNA在实验性自身免疫性肌炎小鼠淋巴结中的表达情况,探讨TLR4在肌炎发病中的作用.方法:将30只雌性BALB/c小鼠随机分为5组(每组6只):第1组为正常对照组,其它4组分别为肌炎模型1周处理组、2周处理组、3周处理组和4周处理组,后4组均应用肌球蛋白诱导实验性自身免疫性肌炎模型(EAM).采用实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠淋巴结TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平.结果:(1)与正常小鼠相比,肌炎各组小鼠淋巴结中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达均有统计学差异,表现为不同程度升高(P＜0.01),第3组升高为显著(P＜0.01),第4组较第5组升高(P＜0.01)；(2)各组淋巴结中TLR4 mRNA表达水平与MyD88 mRNA、NF-κBmRNA表达水平均呈正相关(r=0.906,r=0.967,P＜O.01),MyD88 mRNA表达水平与NF-κB mRNA表达水平呈正相关(r =0.919,P＜0.01).结论:TLR4在自身免疫性肌炎发生发展过程中发挥重要作用,且以MyD88依赖型信号途径为主,并通过激活NF-κB促进炎性因子释放.
关键词： 实验性自身免疫性肌炎 TLR4 MyD88 NF-kB -
高氧对脂多糖诱导N9小胶质细胞促炎症作用的影响
目的:观察常压高浓度氧对脂多糖诱导N9小胶质细胞Toll受体4、TNF-α表达时序变化,初步探讨高氧对小胶质细胞促炎反应的作用及调控机制.方法:体外培养N9小胶质细胞,随机分为6组(n=3):空气组、sLPS组、hLPS组、高氧组、高氧+ sLPS组、高氧+hLPS组.LPS浓度为100 ng/mL(sLPS)、1 mg/L( hLPS).高氧(900 mL/L)暴露时间分别为2h、6h、12 h、16 h、24h.RT-PCR检测TLR4的表达时序变化；Western blot检测处理12 h后各组TLR4蛋白表达；ELISA检测各组处理6h、12 h、16 h、24h培养上清中TNF-α的含量.结果:RT-PCR显示hLPS组在6h后、sLPS组在16 h后TLR4 mRNA均表达上调,并随LPS浓度增加、暴露时间延长逐渐升高(P＜0.05),24 h时hLPS组表达高.6h后在各个时间点高氧+ hLPS组与hLPS比较TLR4 mRNA下调(P＜0.05),在16 h、24h为明显(P＜0.05).Western blot检测12 h高氧+sLPS组、高氧+hLPS组TLR4蛋白水平均低于相应浓度的LPS组(P＜0.05).ELISA结果示在各个时间点高氧+ sLPS组、高氧+hLPS组与相应浓度的LPS组比较TNF-α均明显上调(P＜0.05).结论:高浓度氧暴露促进LPS诱导N9小胶质细胞的促炎症反应,TLR4可能参与此过程的负向调控.
