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问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121的初步研究
钩端螺旋体病的传染和流行常给人类生命及畜牧业生产造成严重危害.我国曾发生过数十次大规模钩端螺旋体病流行.作为我国两个流行菌型之一的问号赖型钩端螺旋体在生物学特性和致病性有其独特性,但其遗传学特性和致病机制尚不完全清楚.为了探讨问号赖型钩端螺旋体抗原基因的特点,应用六种常见内切酶(BamHI,Bgl Ⅱ,EcoRI, Hind Ⅲ, Pst Ⅰ, Pvu Ⅱ)对从问号赖型钩端螺旋体017株的基因文库中筛选出来的重组质粒pDL121外源基因进行酶谱分析,同时用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体基因进行杂交分析.结果显示问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017, serovar hebdomadis strain 56 610, serovar pomona strain 56 608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc Ⅰ, serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌.结果提示重组质粒pDL121外源基因可能是问号赖型钩端螺旋体的一个新基因,进一步测序分析将揭示该基因本质,同时因该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体,提示其可用于钩端螺旋体病的早期诊断及钩端螺旋体的鉴定和分类.
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问号赖型钩端螺旋体23 kDa蛋白的免疫原性研究
钩端螺旋体病(简称钩体病)是分布广的一种人兽共患病,已有77个国家和地区有钩体病的流行,给人类和畜牧业造成了严重危害.为了控制钩体病流行,目前多采用全菌死疫苗.但是,全菌死疫苗免疫持久性不强,而且需多次注射,因而有严重的局限性.因此,寻找由钩体基因编码的保护性抗原,使之持久地抵抗侵入机体的钩体,已成为钩体病研究的课题.我们前文已报道问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121可表达被全钩抗血清识别的23 kDa蛋白(刘洪斌等,以Lambda gt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的克隆和在E.coli表达的研究.华西医科大学学报,1997, 28(1):18.为了探讨pDL121的1.0 kb 017株问号赖型钩端螺旋体DNA片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选,采用SDS-PAGE制备23 kDa蛋白,免疫日本大耳兔制备抗23 kDa抗血清,Western blot鉴定其免疫原性.结果显示:23 kDa重组抗原兔抗血清可识别pDL121体外表达23 kDa抗原产物和问号赖型钩端螺旋体017株超声抗原成份:用Western blot鉴定抗血清效价,其抗体滴度为1/12 800;用pDL121重组质粒主动免疫豚鼠,可使豚鼠抵抗强毒力株钩端螺旋体攻击,表现出免疫保护作用.本实验结果提示:该重组23 kDa抗原有良好的免疫原性,可能是赖型钩体017株的保护性抗原.
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建
目的:为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA 3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpG motifs,因而可发挥佐剂作用.方法:提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物:P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果:经酶切鉴定证实:有一1.8 kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8 kb可被酶切为9.6 kb及8.5 kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实:P1、P2引物扩增出9.6 kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5 kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论:表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因与质粒DNA表达载体中CpG特定核苷酸序列及其在DNA疫苗中的作用
目的:对赖型钩体DNA疫苗包括内鞭毛蛋白基因和质粒DNA表达载体的CpG特定结构进行分析,为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础.方法:以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原,对内鞭毛蛋白基因(flaB2)及质粒DNA表达载体(VR1012)全核苷酸序列进行计算机分析.以flaB2与VR1012构建重组DNA进行NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验.结果:flaB2共846 bp, G+C%为47.9%;赖型钩体全基因组G+C%为36.8%,内鞭毛的G+C%比基因组高;CG特定核苷酸序列共51个,平均16.59%个bp有1个;flaB2中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共3个,分别为GACGCT 1个,GACGTC 1个,GACGCC1个;质粒DNA表达载体VR1012共4914bp,G+C%为49.4%,CG特定核苷酸序列共250个,平均19.66个bp有1个,VR1012中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共16个,分别为GACGTC 5个,GACGCT 2个,GACGCC 1个,GACGTT 1个,GGCGTT 2个,GGCGCT 2个,GGCGCC 1个,AACGCT 1个,AACGCC 1个和特别重要的TGACGTCA 4个和TAACGCCA有1个,位于5′端456-463;509-516;592-599;778-785,486-493;4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5′端且相对集中.TCG分散共53个,TCGTCG共1个,位于1 873-1 878,NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验的结果表明,加强注射接种后3周"VR1012+flaB2”组动物抗体效价增高(16倍),试验组存活率为90%.结论:研究结果表明赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因及其质粒DNA表达载体构成的DNA疫苗具有明显的免疫原性和免疫保护作用,经DNA分析表明DNA疫苗中特别是质粒表达载体含有TGACGTCA等特定结构,是提高DNA疫苗免疫效能,减少疫苗免疫接种剂量一种行之有效的措施.
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建
目的为增强问号赖型钩端螺旋体(钩体017株)DNA疫苗内鞭毛蛋白基因(flaB2)与外膜抗原基因(ompL1) 的免疫保护作用,构建一种能表达flaB2与ompL1蛋白融合蛋白的DNA疫苗载体.方法通过聚合酶链反应分别扩增017钩体flaB2与ompL1片段并进行融合,获得的嵌合基因ompL1-flaB2中含有10个氨其酸的中间接头序列,以维持其空间构象.结果经酶切鉴定,证实有一1.8kb片段插入载体,其flaB2及ompL1 DNA测序结果与文献报道的一致.结论表达017株钩体flaB2与ompL1抗原融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功.
